Blu di metilene e progeria: lezioni da un modello di invecchiamento cellulare

Il cambiamento di una sola lettera in un gene fa invecchiare i bambini a una velocità spaventosa. Perdita di capelli, rigidità articolare, restringimento delle arterie e un'aspettativa di vita che si ferma all'adolescenza. Questa malattia è la sindrome di progeria di Hutchinson-Gilford e, per anni, la ricerca si è concentrata sul nucleo, dove la proteina mutata causa i suoi danni. Uno studio del 2016 dell'Università del Maryland ha posto una domanda diversa: che aspetto hanno i mitocondri in queste cellule? La risposta ha collegato due compartimenti della cellula, e un colorante blu vecchio di un secolo ha agito su entrambi.

Lo studio è quello di Xiong e colleghi, pubblicato su Aging Cell nel 2016. È stato condotto interamente su cellule in coltura. Questo fatto è il punto di riferimento per tutto ciò che segue. I risultati sono reali e specifici. Altrettanto precisa è la loro distanza da qualsiasi trattamento.

Il modello: una mutazione, una proteina che resta ancorata

La progeria inizia con una sostituzione da C a T nella posizione 1824 del gene LMNA. Il cambiamento non modifica un amminoacido. Attiva un sito di splicing nascosto, che elimina 50 amminoacidi dalla proteina lamina A. Il prodotto accorciato, chiamato progerina, perde il sito di taglio che normalmente permetterebbe alla cellula di rimuovere il suo ancoraggio farnesilico. La progerina rimane quindi permanentemente farnesilata e ancorata alla membrana nucleare interna, dove la lamina A normale si assocerebbe e dissocerebbe ciclicamente.

Le conseguenze sul nucleo sono ben documentate e visibili al microscopio. I nuclei sviluppano protuberanze e pieghe invece di mantenere una forma ovale regolare. L'eterocromatina, il DNA silente densamente compattato che normalmente riveste il bordo del nucleo, si assottiglia. Migliaia di geni cambiano espressione. Immaginate la lamina nucleare come un'impalcatura dietro la carta da parati: quando un elemento dell'impalcatura viene saldato nella posizione sbagliata, la parete si deforma e il disegno della carta si distorce in tutta la stanza.

Lo studio ha utilizzato fibroblasti cutanei di pazienti con progeria insieme a cellule di controllo con lo stesso numero di passaggi in coltura, oltre a una seconda linea modificata in modo che fibroblasti normali producessero direttamente progerina. Le cellule modificate hanno sviluppato gli stessi difetti, attribuendone la causa alla progerina anziché alla storia dei pazienti o al tempo trascorso in coltura. La gravità seguiva la quantità: la linea che esprimeva più progerina mostrava difetti più marcati in tutti i parametri.

Che aspetto avevano i mitocondri

Nei fibroblasti sani, i mitocondri formano una rete ramificata attorno al nucleo, costituita da lunghi tubuli che si muovono lungo i binari del citoscheletro. Nelle linee con progeria questa rete era scomparsa. Una quota maggiore di mitocondri era frammentata, molti erano rigonfi e la microscopia elettronica mostrava un aumento di circa due volte degli organelli gravemente danneggiati. Le immagini in time-lapse mostravano che percorrevano distanze inferiori a velocità più basse rispetto ai controlli.

La funzione rispecchiava la forma. Il superossido mitocondriale e i livelli di ossidanti nell'intera cellula aumentavano. Un maggior numero di cellule mostrava un potenziale di membrana alterato. La produzione di ATP diminuiva. Presi singolarmente, questi risultati non sorprendono, poiché i mitocondri danneggiati rilasciano specie reattive dell'ossigeno e producono meno energia. La novità era la causa proposta. PGC-1alpha, il coattivatore trascrizionale che promuove la biogenesi mitocondriale attraverso fattori a valle come NRF1, TFAM e i regolatori della fusione e della fissione MFN1, MFN2, OPA1, FIS1 e DRP1, risultava ridotto di circa otto volte a livello di mRNA nelle cellule con progeria, con una corrispondente diminuzione della proteina. La progerina sembrava reprimere l'interruttore principale per la formazione e il mantenimento dei mitocondri. Questo legame tra il danno alla lamina nucleare e il metabolismo energetico rientra nel quadro più ampio della produzione di energia mitocondriale, mentre il versante ossidante dello stesso equilibrio è trattato nell'ambito dello stress ossidativo e del controllo delle ROS.

Cosa ha cambiato il blu di metilene

I ricercatori hanno trattato le cellule con blu di metilene a 100 nanomolare, una bassa concentrazione, in modo continuo per settimane. Nel contesto delle colture cellulari, si tratta di un'esposizione prolungata e a bassa intensità, non di un breve impulso farmacologico. Il blu di metilene passa ciclicamente tra forme ossidate e ridotte e può trasportare elettroni all'interno dei mitocondri. Per questo viene descritto come un composto redox che agisce sui mitocondri, anziché come un comune antiossidante che si consuma quando neutralizza un ossidante.

I mitocondri hanno risposto sia nelle cellule normali sia in quelle con progeria. L'ATP è aumentato, i livelli di ossidanti sono diminuiti e la quota di mitocondri gravemente difettosi si è ridotta. L'espressione di PGC-1alpha è stata parzialmente ripristinata, insieme ad alcuni dei suoi bersagli a valle. Fin qui si tratta di un effetto generale di sostegno alla funzione mitocondriale, non specifico della progeria.

I risultati sul nucleo sono stati la sorpresa, ed erano specifici delle cellule malate. L'analisi quantitativa della forma ha mostrato una diminuzione delle protuberanze nucleari. Le quantità totali di lamine A e C sono aumentate. Il dato più sorprendente è stato la ridistribuzione della progerina: nelle cellule con progeria non trattate, solo circa il 30 percento della progerina si trovava nella frazione nucleoplasmatica solubile, mentre il resto era ancorato alla membrana. Dopo il trattamento, la quota solubile è salita a circa il 65 percento, avvicinandosi al comportamento normale delle lamine. Liberata dalla membrana, la progerina trascina con sé meno proteine vicine, e anche le frazioni solubili delle lamine A e C si sono ripristinate.

A valle di questo distacco, due fenotipi nucleari sono migliorati. L'eterocromatina perinucleare, esaminata mediante microscopia elettronica e colorazione per la proteina dell'eterocromatina HP1-alpha, risultava visibilmente ripristinata. Il sequenziamento dell'RNA ha inoltre mostrato che il trascrittoma tornava verso la normalità: le cellule con progeria non trattate differivano dai controlli per oltre 3,200 geni, mentre quelle trattate differivano per circa 1,670. Nelle cellule normali, lo stesso trattamento modificava solo poche decine di geni, suggerendo che l'effetto nucleare fosse legato alla progerina anziché a una perturbazione trascrizionale generale. Il principio secondo cui i modelli cellulari e animali rispondono a domande più circoscritte di quanto suggeriscano i titoli è spiegato in come leggere la ricerca sul blu di metilene.

Perché questo non è un trattamento

Quattro limiti mantengono questo studio dove deve stare: all'interno del laboratorio.

Primo, tutto è avvenuto in piastre di coltura. Ai fibroblasti in coltura mancano l'apporto sanguigno, il contesto immunitario, l'architettura dei tessuti e la farmacologia dell'intero organismo, che determina se un composto raggiunge effettivamente un bersaglio. In questo studio non è stato somministrato alcun composto ad animali e non è stato trattato alcun paziente.

Secondo, i fibroblasti con progeria sono un modello di un solo tipo cellulare. La malattia causa la morte principalmente attraverso il coinvolgimento di arterie, ossa e tessuto adiposo, e lo studio ha esaminato soltanto fibroblasti e una preparazione di muscolatura liscia. Altri tessuti potrebbero comportarsi diversamente.

Terzo, il recupero nucleare è derivato da settimane di esposizione continua a concentrazioni nanomolari nel terreno di coltura. Le concentrazioni in una piastra non sono dosi, e nulla nello studio permette di convertire 100 nanomolare nel terreno in uno schema di trattamento per l'uomo. Il blu di metilene ha una propria relazione dose-risposta e un proprio profilo di sicurezza in altri ambiti della medicina, e questo studio non fornisce alcuna base per l'uso domestico. Il contesto generale sulla sicurezza è trattato in sicurezza ed effetti collaterali del blu di metilene.

Quarto, la progeria non è il normale invecchiamento. È una malattia rara dovuta a una singola mutazione, in cui l'impalcatura nucleare si danneggia in un modo particolare. Un composto che attenua quel danno specifico nelle cellule in coltura dice poco sull'invecchiamento nelle persone prive della mutazione. Il fenotipo cellulare è una finestra sulla comunicazione tra nucleo e mitocondri, non un risultato sulla longevità.

La sintesi corretta è quindi circoscritta al modello. Nei fibroblasti con progeria, la progerina reprime PGC-1alpha e lascia i mitocondri frammentati, poco mobili, ricchi di ossidanti e poveri di energia. Il blu di metilene a bassa concentrazione ha ripristinato i parametri mitocondriali in tutte le cellule e, nelle cellule malate, ha inoltre liberato la progerina dalla membrana nucleare, con un recupero parziale della forma del nucleo, dell'eterocromatina e dell'espressione genica. Questa doppia azione rende lo studio degno di attenzione. Non rende il blu di metilene una terapia per la progeria o per l'invecchiamento.