Blu di metilene e segnalazione infiammatoria: inflammasomi, IL-6 e STAT3

Supponiamo che tre laboratori riferiscano che lo stesso composto blu è antinfiammatorio. Uno mostra una minore produzione di IL-1beta da parte dei macrofagi. Uno mostra una minore quantità dell'enzima iNOS nello stesso tipo cellulare. Uno mostra meno IL-6 nel sangue e una minore attività di STAT3 nel cervello. La tentazione è riunire i tre risultati in un'unica affermazione. Questa fusione nasconde ciò che è stato osservato.

Ogni risultato appartiene a un diverso meccanismo di segnalazione, con un proprio stimolo, una propria fase di assemblaggio e un proprio parametro misurato. Il blu di metilene interviene in ciascun meccanismo in un punto diverso. Stabilire se tutto questo migliori un esito di salute è una questione separata, trattata nella nostra panoramica sul blu di metilene e l'infiammazione. Questa pagina si concentra sulle vie di segnalazione.

Via 1: assemblaggio dell'inflammasoma e caspasi-1

Un inflammasoma è un'impalcatura proteica costruita al bisogno all'interno di una cellula mieloide. I suoi componenti sono un sensore, un adattatore chiamato ASC e un enzima effettore chiamato caspasi-1. Una volta completato l'assemblaggio, la caspasi-1 scinde pro-IL-1beta e pro-IL-18 nelle rispettive forme secrete e può innescare la piroptosi, una forma infiammatoria di morte cellulare. Il sensore ne definisce il tipo: NLRP3 risponde ai cristalli e alle tossine che formano pori, come la nigericina, e all'ATP; NLRC4 risponde alla flagellina batterica; AIM2 risponde al DNA citosolico a doppio filamento; la via non canonica risponde al lipopolisaccaride intracellulare.

L'attivazione richiede due segnali. Il primo segnale è il priming: un ligando di un recettore Toll-like induce la trascrizione di NLRP3 e pro-IL-1beta dipendente da NF-kB, rendendo disponibili i componenti. Il secondo segnale è l'assemblaggio: un secondo stimolo fa sì che ASC oligomerizzi formando aggregati puntiformi, che la caspasi-1 venga scissa generando il frammento p20 e che venga rilasciata IL-1beta p17 matura. Le specie reattive dell'ossigeno mitocondriali e l'internalizzazione dei cristalli sono fattori noti che contribuiscono al secondo segnale per NLRP3.

Lo studio del 2017 sui macrofagi e sull'inibizione di diversi inflammasomi ha valutato il blu di metilene in entrambe le fasi di segnalazione. In macrofagi del midollo osseo murino sottoposti a priming con lipopolisaccaride, nigericina, ATP e cristalli di urato monosodico inducevano ciascuno il rilascio di IL-1beta e caspasi-1, oltre alla formazione di aggregati puntiformi di ASC; il blu di metilene a concentrazioni da 20 a 200 micromolari riduceva tutti e tre i parametri in modo dose-dipendente, senza uccidere le cellule. La flagellina e Salmonella per NLRC4, il DNA a doppio filamento e Listeria per AIM2, e il lipopolisaccaride introdotto mediante trasfezione o E. coli vivo per la via non canonica mostravano lo stesso andamento. Il composto da solo non innescava il rilascio e le piastre di controllo non mostravano alcun effetto antibatterico: il risultato riguarda quindi la risposta dell'ospite.

A monte sono stati misurati tre effetti. Il superossido mitocondriale indotto dal rotenone diminuiva con il blu di metilene, così come il rilascio di IL-1beta indotto dal rotenone. Diminuiva anche l'internalizzazione di microsfere fluorescenti, coerentemente con una riduzione della fagocitosi prima del riconoscimento dei cristalli. Un sistema reporter controllato dal promotore di NLRP3 con due siti per NF-kB mostrava un'attività inferiore in presenza di blu di metilene, mentre un promotore troncato privo di quei siti non rispondeva. In una provetta senza cellule, il blu di metilene riduceva anche direttamente l'attività della caspasi-1 umana ricombinante. L'aggiunta del composto soltanto durante il priming o soltanto durante l'attivazione riduceva comunque il rilascio di IL-1beta, IL-18 e caspasi-1, indicando il coinvolgimento di entrambe le fasi.

Gli esperimenti nei topi confermavano questa selettività. Una dose letale di lipopolisaccaride uccideva gli animali di controllo nel giro di poche ore, mentre il blu di metilene migliorava la sopravvivenza; l'IL-1beta peritoneale diminuiva, ma l'IL-6 nello stesso liquido no. In un modello di peritonite da Listeria, l'IL-1beta peritoneale diminuiva, mentre il numero totale di cellule rimaneva invariato. I monociti umani THP-1 si comportavano come i macrofagi murini per tutti e quattro i tipi di inflammasoma. Un risultato relativo all'inflammasoma spiega la maturazione di IL-1beta e IL-18, non quella di ogni citochina: è anche per questo che la morfologia delle cellule immunitarie cerebrali negli esperimenti su microglia e astrociti risponde a una domanda diversa rispetto all'assemblaggio dell'impalcatura proteica.

Via 2: trascrizione di iNOS tramite il legame di NF-kB e STAT1

La sintasi inducibile dell'ossido nitrico, o iNOS, è scarsamente presente a riposo e viene trascritta al bisogno. Il lipopolisaccaride ne induce la trascrizione principalmente tramite la degradazione di IkB-alpha, seguita dalla fosforilazione di NF-kB e dal suo ingresso nel nucleo. L'interferone-gamma la induce principalmente tramite la fosforilazione di STAT1 da parte delle chinasi Janus, seguita dall'ingresso di STAT1 nel nucleo. Ogni fattore si lega poi al proprio sito sul promotore di iNOS. L'attività enzimatica e l'induzione genica sono punti di controllo separati, e un farmaco può agire su uno dei due o su entrambi.

Lo studio del 2015 sull'induzione di iNOS nei macrofagi e nei topi endotossiemici ha collocato l'effetto a livello del messaggio. Nelle cellule RAW 264.7 e nei macrofagi murini primari, il blu di metilene a 1 micromolare, somministrato 30 minuti prima del lipopolisaccaride, dell'interferone-gamma o di entrambi, riduceva la proteina iNOS e il suo mRNA nell'arco di 8–24 ore, con meno nitrito nel mezzo e nessuna perdita di vitalità. Nei topi che ricevevano 25 mg per kg di lipopolisaccaride, una singola dose di 5 mg per kg somministrata un'ora prima riduceva la proteina iNOS e il suo mRNA nel polmone, nel fegato e nel cuore.

Il dettaglio distintivo è ciò che non cambiava. La degradazione di IkB-alpha, la fosforilazione di NF-kB, la fosforilazione di STAT1 e l'accumulo nucleare di entrambi i fattori rimanevano intatti. L'interruzione avveniva un passaggio dopo: gli estratti nucleari mostravano un minore legame di NF-kB al suo elemento di DNA dopo il lipopolisaccaride e un minore legame di STAT1 dopo l'interferone-gamma; l'immunoprecipitazione della cromatina confermava una minore occupazione del promotore di iNOS da parte di entrambi i fattori all'interno delle cellule. Diminuiva anche il fattore di necrosi tumorale alfa, il cui promotore utilizza anch'esso NF-kB. I fattori erano attivati e arrivavano nel nucleo, ma si legavano poco al loro DNA bersaglio.

Si noti il contrasto con la via 1. Qui si tratta del legame dei fattori al DNA, è coinvolto STAT1 anziché STAT3 e si misurano mRNA, proteina e nitrito anziché aggregati puntiformi di ASC e frammenti di caspasi-1. La nostra mappa dei bersagli del blu di metilene nei modelli cellulari mantiene questo livello trascrizionale separato dalle misurazioni dirette degli enzimi e dei mitocondri.

Via 3: IL-6 sierica e attivazione tissutale di STAT3

IL-6 trasmette il segnale attraverso la famiglia di recettori gp130 alla cascata dalle chinasi Janus a STAT3. STAT3 fosforilato dimerizza, entra nel nucleo e attiva programmi infiammatori, mentre IL-6 è a sua volta un bersaglio di NF-kB: i due formano quindi un circuito di retroazione spesso chiamato asse IL-6–STAT3. I parametri standard misurati sono l'IL-6 sierica a monte, il rapporto tra STAT3 fosforilato e STAT3 totale, e gli enzimi effettori come iNOS e COX2 a valle.

Lo studio murino del 2023 su IL-6 e STAT3 dopo il lipopolisaccaride ha misurato l'asse in diversi compartimenti. Topi maschi C57BL/6 ricevevano 1 mg per kg di lipopolisaccaride al giorno per tre giorni, con 5 o 10 mg per kg di blu di metilene 30 minuti dopo ciascuna dose. Il terzo giorno, l'IL-6 sierica era inferiore in entrambi i gruppi trattati con blu di metilene rispetto al gruppo trattato con il solo lipopolisaccaride, mentre la maggior parte delle altre citochine del pannello non variava con il trattamento. I rapporti tra STAT3 fosforilato e STAT3 totale erano inferiori nella corteccia, nell'ippocampo e nella cute dell'orecchio, con una minore marcatura microgliale per Iba-1, livelli inferiori di iNOS e COX2 e una perdita di peso parzialmente attenuata.

Qui sono necessarie due cautele. La riduzione dell'IL-6 sierica insieme alla minore fosforilazione tissutale di STAT3 è compatibile con una modulazione dell'asse, ma non identifica il nodo primario: una minore quantità di citochina a monte, una minore segnalazione recettoriale o un'attività fosfatasica alterata potrebbero produrre lo stesso rapporto. Inoltre, il peso durante tre giorni di stimolazione acuta è un parametro dell'intero animale, non un punteggio dei sintomi o della remissione. Aggiunge contesto rispetto al solo risultato di un blot, senza trasformare un risultato di segnalazione in un'affermazione terapeutica. La chimica distinta della gestione redox mitocondriale procede in parallelo a questo quadro delle citochine e non va confusa con esso.

Confronto delle vie: punti di intervento e parametri misurati

La tabella impedisce tre estrapolazioni non valide. Un risultato sugli aggregati puntiformi di ASC non dimostra un risultato su STAT3. Un risultato sul legame di STAT1 al promotore di iNOS non dimostra un risultato su STAT3, anche se entrambe le proteine appartengono alla famiglia STAT. Un risultato sull'IL-6 sierica non dimostra una riduzione dell'assemblaggio dell'inflammasoma: nell'esperimento peritoneale l'IL-1beta diminuiva, mentre l'IL-6 no. Ogni riga richiede il proprio stimolo e il proprio parametro misurato: per questo, nella lettura degli studi sul blu di metilene condotti su cellule, animali e pazienti, è essenziale associare ogni affermazione al livello effettivamente misurato.

Nulla di tutto questo stabilisce dosaggio, sicurezza o benefici nelle persone. I modelli con lipopolisaccaride sono stimoli controllati per verificare un meccanismo, non repliche di una malattia cronica; inoltre, la somministrazione in concomitanza con lo stimolo verifica la prevenzione di un cambiamento indotto, anziché la regressione di una malattia già presente. Mantenete questa descrizione dei meccanismi separata dagli esiti nei pazienti e valutate qualsiasi affermazione sulla salute sulla base dello studio sui pazienti che la sostiene.