Auðkenning metýlenblátts á rannsóknarstofu: innrauð litróf og viðbótaraðferðir

Ímyndaðu þér að þrjár rannsóknarstofur fái sama bláa duftið. Sú fyrsta skráir innrautt litróf og lýsir því yfir að efnið sé metýlenblátt. Sú önnur framkvæmir litskiljun og greinir frá 0.4% Azure B. Sú þriðja mælir bognun röntgengeisla frá kristöllunum og tilgreinir hýdratform. Allar þrjár hafa rétt fyrir sér og engin þeirra hefur svarað hinum tveimur spurningunum. Ruglingur hefst þegar ein niðurstaða er túlkuð sem svar við öllum þremur.

Þessi grein greinir þessar spurningar að. Innrauð auðkenning staðfestir sameindaauðkenni með samanburði við viðmiðunarstaðal. Litskiljun staðfestir efnasamsetningu. Geislabognun staðfestir form í föstu ástandi. Fullnægjandi samsvörun við auðkenningu er ekki hreinleikavottorð.

Innrauð auðkenning svarar einni spurningu vel

Auðkenningarpróf lyfjaskrár fyrir metýlenblátt felst í samanburði litrófs við staðal, ekki gátlista yfir toppa. Í forskoðun USP-eingreiningar fyrir metýlenblátt vísar auðkenningarpróf A til innrauðrar litrófsgreiningar með annaðhvort ATR-ljósbúnaði eða kalíumbrómíðtöflu. Litróf sýnisins verður að samsvara litrófi USP-viðmiðunarstaðalsins, þar sem sýni og staðall eru útbúin og litrófin skráð við sambærilegar aðstæður. Enginn fastur listi yfir einkennandi bylgjutölur ræður niðurstöðunni. Það gerir samlagning litrófanna.

Þetta fyrirkomulag endurspeglar hegðun FTIR-litrófa metýlenblátts. Sterkustu einkennin liggja á fingrafarasvæðinu. Túlkanir í fræðiritum staðsetja helsta band samtengda hringkerfisins yfirleitt nálægt 1590 til 1600 cm-1, þar sem teygjusveiflur arómatískra kolefnis-kolefnis- og kolefnis-köfnunarefnistengja tengjast saman. Önnur bönd nálægt 1490 og 1390 cm-1 tengjast aflögun hringa, kolefnis-köfnunarefnistengja og kolefnis-vetnistengja. Bönd nálægt 1355 og 1330 cm-1 tengjast kolefnis-köfnunarefnistengjum dímetýlamínóhópanna og aflögun metýlhópa. Einkenni nálægt 1225 til 1250 cm-1 tilheyra misleita hringkerfinu, en bönd nálægt 1170 til 1130 og 1066 cm-1 tengjast kolefnis-brennisteinstengjum, með beygjusveiflum arómatískra C-H-tengja nálægt 880 cm-1. Teygjusveiflur koma fram við hærri bylgjutölur: arómatísk C-H-tengi nálægt 3040 cm-1 og N-metýl C-H-tengi á bilinu um það bil 2900 til 3000 cm-1. Birtar túlkanir eru mismunandi í smáatriðum vegna þess að fenóþíasíníumgrindin sveiflast sem samtengt kerfi. Líttu því á hverja einstaka túlkunartöflu sem birta túlkun fremur en ótvíræða niðurstöðu.

Tvenns konar áhrif sýnaundirbúnings verðskulda athygli vegna þess að þau breyta IR-litrófum metýlenblátts án þess að breyta litarefninu. Í fyrsta lagi sýnir hýdratað efni breitt O-H-band um 3300 til 3500 cm-1 ásamt beygjusveiflum vatns nálægt 1630 til 1640 cm-1, og mismunandi hýdratform færa bönd á fingrafarasvæðinu mælanlega til. Í öðru lagi er KBr-fylki töflunnar rakadrægt: raki sem það dregur í sig myndar bönd á nákvæmlega þessum vatnssvæðum og getur virst vera kristalvatn úr sýninu. Með ATR-mælingu er KBr-fylkið ekki til staðar, en styrkur ATR-banda fylgir gegnumþrengidýpt sem er háð bylgjutölu. Því er ekki hægt að leggja ATR-litróf og gegnumslagslitróf sama dufts beint hvort yfir annað. Hagnýta reglan leiðir af kröfu lyfjaskrárinnar: berðu saman sýni og viðmiðun sem mæld eru með sömu tækni og skráðu hvaða tækni var notuð. Um efnafræði katjónarinnar, saltsins og hýdratanna að baki þessum litrófum má lesa í yfirliti um byggingu og eiginleika metýlenblátts.

Tafla til að velja greiningaraðferð

Þessi tafla hjálpar við val á aðferð. Lestu þvert yfir hverja röð til að sjá hvaða spurningu aðferðin svarar, hvað fullnægjandi niðurstaða staðfestir og hvað er enn ósannað.

Hvers vegna samsvörun innrauðra litrófa er ekki hreinleikavottorð

Samsvörun við auðkenningu útilokar rangt litarefni. Hún veitir ekki tæmandi yfirlit yfir innihald sýnisins. Þrjár takmarkanir skipta mestu máli.

Í fyrsta lagi líkjast náskyld efni hvert öðru í innrauðu litrófi. Azure B er frábrugðið metýlenbláu um aðeins einn metýlhóp og litróf þess líkist því mjög litrófi metýlenblátts. Blanda sem inniheldur nokkur prósent Azure B fellur enn vel saman við viðmiðunarlitróf metýlenblátts. Greining þessara óhreininda er verkefni fyrir litskiljun, sem fjallað er um í leiðarvísi um óhreinindi í metýlenbláu og prófunaraðferðir.

Í öðru lagi er innrauð litrófsgreining aðferð sem mælir sýnið í heild og hefur takmarkað næmi fyrir efnisþáttum í litlu magni. Lítið magn skyldra litarefna, leysiefnaleifa eða ólífrænna leifa leynist undir meginböndunum. Að engir viðbótartoppar sjáist er veik vísbending um að engin óhreinindi séu til staðar.

Í þriðja lagi ræður viðmiðunarstaðallinn öllum samanburðinum. Staðall sem hefur brotnað niður, fengið tilfærslu í litrófi vegna breytts hýdratforms eða verið meðhöndlaður ranglega breytir viðmiðinu. Það gerir einnig ósamræmi í mælitækni, svo sem þegar ATR-litróf sýnis er metið út frá KBr-viðmiðun. Skráðu lotu staðalsins, mælitækni og sýnaundirbúning með hverri niðurstöðu.

Blöndur gefa enn eitt tilefni til varúðar. Litróf sem samsvarar að mestu en hefur axlir á böndum eða óeðlilega bandstyrki er ekki fullnægjandi niðurstaða með neðanmálsgreinum. Það er merki um að aðskilja þurfi sýnið áður en það er auðkennt.

Viðbótaraðferðir í framkvæmd

HPLC-greining metýlenblátts veitir upplýsingar um efnasamsetningu sem innrauð greining getur ekki veitt. Núverandi aðferð lyfjaskrárinnar notar súlu af fenýlgerð með vatns-asetónítrílstigul sem inniheldur tríflúorediksýru og greinir við 246 nm, ekki á sýnilega sviðinu. Auðkenning byggist á samsvörun rástíma við viðmiðunarstaðalinn; sami samanburður gefur magngreininguna. Í prófinu fyrir lífræn óhreinindi er Azure B auðkennt með eigin viðmiðunarefni við hlutfallslegan rástíma nálægt 0.8 miðað við 1.0 fyrir metýlenblátt, og krafist er mikillar aðgreiningar milli toppanna tveggja. Taktu eftir vali bylgjulengdar: afmetýlerunarröðin gleypir sífellt nær rauða enda litrófsins, frá þíóníni nálægt 600 nm, í gegnum Azure C, Azure A og Azure B, að metýlenbláu nálægt 670 nm. Nemi sem er stilltur á bylgjulengd nálægt 660 nm svarar því efnunum í röðinni með mismunandi hætti og vanmetur sum samstæð efnasambönd. Þegar þarf heildstætt yfirlit yfir alla röðina á að nota C18 LC-MS/MS-aðferð með hæfnisprófuðum stöðlum fyrir hvert greiningarefni.

Duftgeislabognun svarar spurningunni um fast efnisform sem báðar aðferðirnar hér að ofan annaðhvort eyða upplýsingum um eða líta fram hjá: þegar duftið er leyst upp fyrir litskiljun hverfa upplýsingar um kristalgerð, og sameindasveiflur veita upplýsingar um tengi fremur en reglulega uppröðun yfir lengri vegalengdir. Geislabognunarmynstur greina á milli hýdratfasa og sýna kristöllun, og metýlenblátt þarfnast slíkrar skoðunar fremur en flest önnur efni. Rannsóknir Ragers og samstarfsfólks á föstu ástandi auðkenndu fimm aðskildar hýdratbyggingar, þar á meðal pentahýdrat, tvö díhýdröt, mónóhýdrat og millistigshýdrat, en ekkert eiginlegt tríhýdrat fannst meðal þeirra forma sem voru greind. Meðhöndlun á rannsóknarstofu skiptir hér máli: raki og hitastig breyta stöðugleika hýdrata og kröftug mölun getur breytt fasanum eða dregið úr kristöllun. Stýrðu því hlutfallsraka og hitastigi, skráðu hvort tveggja og haltu mölun í lágmarki. Nánar er fjallað um merkingar hýdrata og áhrif þeirra á veginn massa í umfjöllun um hýdratform metýlenblátts og merkingar.

UV-Vis gleypni gegnir stuðningshlutverki. Þekktu hámörkin staðfesta vænta hegðun lausnar og gera kleift að mæla styrk. Blá lausn sem gleypir við vænta bylgjulengd samræmist þó metýlenbláu án þess að sanna auðkenni þess, þar sem skyld litarefni gleypa við nálægar bylgjulengdir.

Hvað á að spyrja um áður en keypt er

Nýttu þennan greinarmun til að móta spurningar við innkaup. Spurðu hvaða lota var prófuð, hvaða tækni staðfesti auðkennið, hvort viðmiðunarefni fyrir Azure B var notað í HPLC-prófinu fyrir óhreinindi og hvort hýdratformið var greint eða aðeins gert ráð fyrir því. Umfram allt skaltu spyrja hvort vottorðið nái yfir alla gæðakröfulýsinguna eða aðeins valin próf. Margir seljendur sem segjast uppfylla kröfur lyfjaskrár prófa aðeins þungmálma. Þá er spurningum um auðkenni, magn aðalefnis, lífræn óhreinindi, leysiefni og örverur enn ósvarað.

Blupreme prófar samkvæmt allri USP-gæðakröfulýsingunni, sem nær yfir auðkenni, hreinleika, lífræn óhreinindi, leysiefnaleifar, frumefnaóhreinindi, glæðileifar, örverumörk og bakteríuendótoxín, í samstarfi við lyfjaframleiðanda sem framleiðir metýlenblátt. Opinbert greiningarvottorð fyrir hverja lotu er birt á síðu Blupreme um gæðaprófanir, svo hægt sé að lesa beint um grundvöll magngreiningar og niðurstöður óhreinindaprófa í stað þess að álykta um þær. Enn þarf að tilgreina útreikningsgrundvöll niðurstaðna nálægt 100%, eins og útskýrt er í leiðarvísi um magngreiningarniðurstöður yfir 100 prósentum. Samsvörun við auðkenningu markar upphaf rannsóknarinnar. Heildstæð gögn ljúka henni.