Metilena biru dan sklerosis multipel: apa yang diuji dalam penelitian hewan

Cari metilena biru untuk MS dan Anda akan menemukan makalah yang tampaknya menjawab pertanyaan yang sama. Kenyataannya tidak. Satu makalah memberikan metilena biru kepada mencit yang sakit sebagai pengobatan. Makalah lainnya tidak pernah mengobati hewan apa pun dengannya. Penelitian itu menggunakan metilena biru hanya sebagai pewarna biru pada irisan tipis sumsum tulang belakang agar ahli patologi dapat melihat mielin di bawah mikroskop.

Inilah konsep utama seluruh artikel. Zat pewarna ini memiliki dua peran dalam biologi dan keduanya tidak memiliki kesamaan selain berasal dari botol yang sama. Sebagai kandidat obat, zat ini diberikan dengan dosis tertentu kepada hewan hidup dan pertanyaannya adalah apakah penyakit berubah. Sebagai pewarna, zat ini diterapkan pada jaringan mati yang sudah difiksasi setelah eksperimen, dan pertanyaannya adalah seperti apa jaringan tersebut terlihat. Jika Anda melewatkan perbedaan ini, Anda akan membaca bagian metode patologi seolah-olah itu adalah hasil pengobatan.

Apa itu EAE, secara sederhana

Experimental autoimmune encephalomyelitis, yang biasanya disingkat EAE, adalah model hewan standar untuk meniru aspek tertentu dari sklerosis multipel. Peneliti mengimunisasi mencit yang rentan dengan fragmen protein mielin ditambah adjuvan kuat. Sistem imun kemudian menyerang sistem saraf pusat hewan itu sendiri. Mencit mengalami kelemahan yang naik dari bagian tubuh bawah dan mudah dinilai pada skala 0 hingga 5, dari ekor yang lemas hingga kelumpuhan tungkai belakang.

Kemudahan penilaian tersebut menjelaskan mengapa EAE populer sekaligus mengapa model ini dapat menyesatkan. MS pada manusia muncul secara spontan, melibatkan kumpulan target yang lebih luas dan kurang terdefinisi, serta menghasilkan gejala optik, sensorik, kognitif, serebelar, dan motorik dengan perjalanan relaps atau progresif. EAE mereproduksi mekanisme tertentu seperti inflamasi, demielinasi, dan cedera akson dalam kondisi terkendali. EAE bukanlah MS versi mini. Pembaca yang menginginkan kerangka umum dapat meninjau bagaimana metilena biru diperkirakan bekerja pada tingkat seluler sebelum menilai klaim mengenai penyakit tertentu.

Dua makalah di bawah ini juga menggunakan antigen EAE yang berbeda, dan hal itu penting. Studi pengobatan menginduksi penyakit dengan MOG35-55, peptida pendek dari myelin oligodendrocyte glycoprotein. Studi patologi menginduksi penyakit dengan MP4, gabungan segmen myelin basic protein dan proteolipid protein. Pilihan strain dan antigen mengubah lokasi munculnya lesi serta perilaku inflamasi, sehingga kedua studi tersebut bukan dua pengulangan dari eksperimen yang sama.

Peta: dari model ke pertanyaan hingga batasan

Biarkan tabel ini tetap terbuka. Ini adalah referensi utama untuk artikel ini. Setiap baris menyatakan pertanyaan klinis apa yang dapat dijawab oleh model tersebut, apa yang sebenarnya diukur, dan di mana batas translasi berada.

Siapa pun yang memeriksa judul berita berikutnya dapat menggunakan kembali kolom yang sama dengan bantuan cara membaca studi praklinis: tanyakan spesies dan antigennya, peran senyawanya, endpoint, serta apakah hasil tersebut menggambarkan perjalanan penyakit atau sekadar potret jaringan pada satu titik waktu.

Hasil pengobatan: apa yang berubah akibat pemberian dosis

Studi pengobatan tahun 2016 di Journal of Neuroimmunology menggunakan mencit C57BL/6 betina, berusia sekitar 8 hingga 10 minggu, yang diimunisasi dengan 250 micrograms MOG35-55 per mencit. Setelah induksi, hewan EAE diacak ke kelompok metilena biru atau kelompok EAE tanpa pengobatan, dan skor klinis dipantau hingga sekitar hari ke-30.

Skor klinis secara signifikan lebih rendah pada mencit yang diobati dibandingkan kontrol EAE dari hari ke-15 hingga hari ke-30, dengan P kurang dari 0.01. Analisis sumsum tulang belakang menunjukkan arah yang sama, yaitu lebih sedikit infiltrasi inflamasi, lebih sedikit demielinasi, dan lebih sedikit kehilangan akson pada hewan yang diobati.

Bagian yang paling khas adalah panel pensinyalannya. Pengobatan meningkatkan aktivasi AMPK dan ekspresi SIRT1 serta menekan aktivasi NF-kB, salah satu pengatur utama inflamasi. Pada sisi imun adaptif, pengobatan mengurangi respons Th17 dan memperkuat respons Treg. Dengan demikian, rangkaian yang diusulkan adalah metilena biru menuju AMPK dan SIRT1, kemudian menurunkan pensinyalan NF-kB, lalu menggeser respons dari Th17 yang proinflamasi menuju Treg yang bersifat regulator, menghasilkan cedera jaringan yang lebih ringan dan akhirnya skor yang lebih rendah.

Rangkaian tersebut merupakan interpretasi, bukan urutan sebab-akibat yang telah terbukti. Studi ini menunjukkan bahwa pemberian obat, perubahan sinyal, dan perbaikan penyakit terjadi bersamaan. Studi ini tidak membuktikan bahwa AMPK dan SIRT1 menghasilkan seluruh manfaat tersebut, dan teks yang tersedia di indeks publik tidak menjelaskan dosis tepat dalam milligram per kilogram, rute pemberian, hari mulai, atau durasi dengan cukup jelas untuk mereproduksi regimen hanya dari abstraknya. Anggap setiap angka dosis mengenai makalah ini yang dikutip di halaman penjualan sebagai belum terverifikasi kecuali halaman tersebut mengutip metode dari teks lengkap. Basis bukti manusia yang lebih luas untuk metilena biru adalah tempat untuk memeriksa apakah sinyal imun awal ini pernah berkembang menjadi data klinis.

Hasil patologi: apa yang ditunjukkan jaringan selama enam bulan

Studi MP4 tahun 2015 di PLoS ONE menggunakan mencit C57BL/6 betina yang diimunisasi dengan 200 micrograms MP4 dalam complete Freund adjuvant ditambah toksin pertusis pada hari imunisasi dan kembali 48 jam kemudian. Tidak ada hewan yang menerima metilena biru sebagai obat. Setelah fiksasi dan embedding, irisan transversal sumsum tulang belakang setebal 1 micrometer diwarnai dengan metilena biru untuk mikroskop cahaya, sementara mikroskop elektron pada traktus ventrolateral digunakan untuk melihat detail yang lebih halus.

Jaringan diambil pada tiga tahap: puncak akut dengan 7 mencit, tiga bulan setelah onset dengan 5 mencit, dan enam bulan setelah onset dengan 10 mencit. Rata-rata skor klinis pada tahap-tahap tersebut tampak hampir identik, sekitar 1.7 hingga 1.8 pada skala 0 hingga 5. Namun, jaringan menunjukkan cerita berbeda. Kerusakan mielin terisolasi meningkat dari sekitar 569,000 serabut per square millimeter pada puncak akut menjadi sekitar 1,496,000 pada enam bulan, dengan perbandingan akut terhadap jangka panjang signifikan pada P sama dengan 0.027. Gabungan kerusakan mielin dan akson meningkat kira-kira dua kali lipat pada enam bulan. Serabut yang mengalami remielinasi tetap di bawah satu persen pada setiap tahap, sebuah rincian yang tidak mendukung ekspektasi tinggi mengenai perbaikan.

Cedera akson mengikuti pola berbentuk U, tinggi pada puncak akut, lebih rendah pada tiga bulan, lalu tertinggi pada enam bulan, dan berkorelasi dengan pembengkakan mitokondria serta berkurangnya jarak antara neurofilamen. Penilaian dilakukan secara tersamar terhadap skor dan tahap, yang memperkuat interpretasi bahwa skor klinis tidak sepenuhnya mencerminkan kerusakan struktural yang terus berlangsung.

Ketidaksesuaian itulah kontribusi utama studi ini bagi pembaca yang membahas MS. Skor disabilitas yang stabil tidak berarti jaringan juga stabil. Hal ini sekaligus menunjukkan mengapa makalah ini tidak dapat mendukung klaim pengobatan metilena biru untuk MS. Studi ini menguji waktu, bukan pengobatan.

Mengapa kedua studi tidak membuktikan manfaat pada pasien

Anggap masing-masing makalah sebagai penelitian yang menjawab pertanyaan sempit dengan baik, tetapi sama sekali tidak menjawab pertanyaan mengenai pasien.

Pertama, penyebabnya berbeda. EAE sengaja dipicu dengan antigen dan adjuvan yang telah ditentukan. MS pada manusia berkembang secara spontan dengan repertoar imun yang lebih luas, mencakup sel T, sel B, imunitas bawaan, dan glia residen. Senyawa yang menggeser respons yang didominasi MOG pada mencit belum tentu menggeser respons manusia yang jauh lebih luas tersebut.

Kedua, fenotipenya berbeda. Kelemahan yang naik dari ekor ke tungkai belakang pada mencit merupakan parameter yang praktis. Namun, hal itu memadatkan heterogenitas MS pada manusia menjadi satu angka motorik. Obat sering kali dapat mengubah skor EAE jangka pendek tanpa mengubah perjalanan penyakit pada manusia, sehingga EAE digunakan sebagai alat skrining dan penelitian mekanisme, bukan sebagai klinik versi mini.

Ketiga, paparan dan waktu pemberian belum terpecahkan. Pemberian dini secara berkelanjutan dalam eksperimen mencit selama 30 day tidak sama dengan penggunaan oral kronis pada seseorang yang sudah memiliki penyakit, dan kedua studi tersebut tidak mengukur kadar obat di sistem saraf. Tanpa hubungan itu, tidak ada jembatan dari konsentrasi pada pelat atau dosis pada mencit menuju regimen manusia.

Keempat, kedua makalah tersebut tidak mereplikasi satu sama lain. Antigennya berbeda, pertanyaannya berbeda, endpoint-nya berbeda, dan dalam satu kasus tidak ada pengobatan sama sekali. Mengutip keduanya bersama-sama sebagai dua studi pengobatan MS yang positif merupakan kesalahan kategori.

Apa artinya bagi pembaca yang menimbang bukti

Tidak ada protokol metilena biru yang telah terbukti untuk MS dalam kedua makalah ini. Studi pengobatan mendukung penelitian lebih lanjut mengenai AMPK, SIRT1, NF-kB, serta keseimbangan Th17 dan Treg pada MOG EAE. Studi patologi mengingatkan bahwa cedera jaringan dapat terus berkembang ketika skor tampak tidak berubah, dan bahwa metilena biru di bagian metode terkadang berarti botol pewarna, bukan obat. Pembaca yang mengikuti penelitian sklerosis multipel yang sedang berlangsung sebaiknya tetap mengingat perbedaan antara pewarna dan obat tersebut. Pertanyaan mengenai keamanan, termasuk risiko pada darah dan interaksi, perlu dibahas dengan klinisi bersama data umum keamanan metilena biru sebelum siapa pun bertindak berdasarkan judul berita dari penelitian laboratorium.

Intinya dapat diringkas dalam satu kalimat. Satu studi yang dikutip memberikan metilena biru kepada mencit MOG EAE dan melaporkan penyakit yang lebih ringan disertai pergeseran imun antiinflamasi, sedangkan studi lain yang dikutip tidak memberikan pengobatan apa pun dan hanya menggunakan metilena biru untuk mewarnai sumsum tulang belakang sambil mendokumentasikan akumulasi kerusakan mielin dan akson selama enam bulan, sehingga kedua studi tersebut tidak membuktikan bahwa metilena biru membantu MS pada manusia.