Metilena biru dan leukometilena biru: satu pasangan redoks, dua warna

Seorang mahasiswa menambahkan beberapa tetes pewarna biru ke dalam labu, menggoyangkannya perlahan, lalu melihat warnanya menghilang. Ia mengocok labu dan warna biru kembali. Tidak ada yang ditambahkan atau dihilangkan di antara kedua keadaan tersebut selain elektron dan kontak dengan udara. Labu itu memuat seluruh pokok bahasan artikel ini: metilena biru dan pasangan tereduksinya, leukometilena biru, yang saling berubah dalam pasangan redoks reversibel dengan warna sebagai indikatornya.

Poin praktisnya adalah yang utama. Perubahan warna bukan efek samping dalam hal ini. Perubahan itu adalah sinyal analitis. Siapa pun yang membuat formulasi dengan metilena biru, melakukan titrasi dengannya, atau mengajarkannya harus mampu menuliskan setengah reaksi dari ingatan, menyebutkan kondisi yang mendorongnya ke kiri atau ke kanan, dan mengidentifikasi pengotor yang mengaburkan hasil.

Pasangan dalam satu persamaan

Metilena biru teroksidasi adalah kation metiltioninium: sistem fenotiazinium datar dengan sulfur dan nitrogen pada cincin pusat serta gugus dimetilamino di setiap ujungnya, yang dipasok sebagai garam klorida. PubChem mencatatnya sebagai metiltioninium klorida, C.I. Basic Blue 9. Dalam air, monomernya menyerap di sekitar 664 nm, yang menghasilkan warna biru yang terlihat oleh mata.

Leukometilena biru (LMB) tereduksi memiliki kerangka yang sama, dengan nitrogen pada cincin pusat terprotonasi dan kromofornya terputus. Senyawa ini tidak bermuatan di sekitar pH netral dan hampir tidak berwarna, dengan absorbansi tampak yang dapat diabaikan serta pita ultraviolet kuat di sekitar 258 nm (entri PubChem untuk leukometilena biru, CAS 613-11-6). Jumlah proton dalam setengah reaksi bergantung pada pH, karena bentuk tereduksi mengalami protonasi dalam kondisi asam (nilai pKa perkiraan di sekitar 4.5 dan 5.8). Tiga rezim mencakup rentang praktis:

MB(+) + 2 e(-) + H(+) <=> LMB, blue <=> colorless (near neutral pH, 1 proton)

MB(+) + 2 e(-) + 2 H(+) <=> LMBH(+), blue <=> colorless (moderately acidic, 2 protons)

MB(+) + 2 e(-) + 3 H(+) <=> doubly protonated leuco species (strongly acidic, 3 protons)

Ketiga penulisan tersebut menggambarkan pasangan yang sama pada keadaan protonasi yang berbeda, suatu hal yang dibahas secara sistematis dalam literatur mengenai perilaku redoks pewarna tiazina. Ketergantungan terhadap pH mengikuti persamaan Nernst untuk Ox + mH(+) + 2e(-) <=> Red, yang menghasilkan kemiringan sekitar 29.6, 59.2, atau 88.7 mV per satuan pH untuk m = 1, 2, atau 3. Kemiringan terukur di sekitar 28, 58, dan 87 mV per satuan pH mengonfirmasi penetapan tersebut, sehingga nilai potensial yang dilaporkan tanpa pH tidak bermakna.

Apa yang ditunjukkan persamaan kepada formulator

Tiga fakta langsung mengikuti stoikiometrinya. Pertama, dua elektron per molekul berarti metilena biru merupakan indikator dan mediator dua elektron, bukan pembawa satu elektron, dalam reaksi bersihnya. Kedua, proton ikut berpartisipasi, sehingga potensial formal berubah bersama pH seperti dijelaskan di atas. Ketiga, potensial formal pada pH 7 berada di sekitar +0.011 V terhadap elektroda hidrogen standar (sekitar +0.53 V pada pH 0), yang menempatkan pasangan ini di antara oksidator ringan: cukup kuat untuk menerima elektron dari donor yang baik seperti NAD(P)H atau askorbat, tetapi cukup lemah untuk menyerahkannya kepada oksigen terlarut atau pusat feri. Posisi di tengah inilah yang membuat pewarna tersebut dapat bersiklus alih-alih terjebak pada salah satu ujung.

Konsentrasi menambahkan satu faktor lagi. Di atas kira-kira seratus mikromolar dalam air, konsisten dengan konstanta disosiasi dimer monomer yang dilaporkan sekitar 170 hingga 250 uM pada pH 7, kation teroksidasi bertumpuk membentuk dimer dan agregat yang lebih besar dengan pita absorpsi bergeser ke sekitar 610 hingga 615 nm. Karena itu, spektrum dengan puncak yang tampak menyimpang dapat menunjukkan agregasi, bukan pengotor. Encerkan terlebih dahulu, lalu nilai hasilnya.

Kondisi yang mendorong masing-masing arah

Tabel di bawah ini adalah referensi untuk pekerjaan di meja laboratorium. Reduksi memerlukan donor elektron; reoksidasi memerlukan akseptor elektron, dan udara biasanya sudah memadai.

Setiap entri mengikuti persamaan yang sama. Hanya gaya pendorongnya yang berubah. Dalam pengertian inilah pasangan tersebut bersifat reversibel: jalurnya sama, tetapi ditempuh dalam arah berlawanan di bawah kondisi yang berlawanan.

Botol biru, dijelaskan

Demonstrasi ini layak dijelaskan mekanismenya secara langsung karena merupakan versi mini dari pasangan tersebut. Dalam larutan glukosa basa, basa mendorong enolisasi glukosa dan enediolat yang terbentuk mereduksi metilena biru menjadi leukometilena biru, sehingga larutan dalam labu menjadi tidak berwarna. Pengocokan melarutkan oksigen dari ruang kepala, oksigen mereoksidasi bentuk leuko, dan warna biru kembali. Saat didiamkan, oksigen terlarut di dekat zona reaksi permukaan berkurang dan glukosa kembali mendominasi. Siklus ini berulang hingga glukosa habis, dan setiap pengocokan merupakan persamaan Nernst yang terlihat: tingkatkan aktivitas oksidator dan kesetimbangan bergeser ke arah biru.

Radikal di tengah

Reaksi bersih memindahkan dua elektron, tetapi langkah elementer memindahkannya satu per satu. Di antara kation biru dan bentuk leuko yang tidak berwarna terdapat intermediat radikal semikuinon yang sebagian besar mengalami disproporsionasi kembali menjadi pasangan tersebut alih-alih terakumulasi. Potensial satu elektronnya di sekitar minus 0.23 V pada pH 7 berada jauh di bawah titik tengah dua elektron bersih, sehingga radikal tersebut tetap menjadi spesies minor pada keadaan tunak. Hal ini penting karena dua alasan. Di bawah penyinaran, pewarna mencapai keadaan tereksitasi yang membuka jalur radikal, sehingga larutan metilena biru sensitif terhadap cahaya dan fotokimia perlu dimasukkan dalam setiap protokol stabilitas. Selain itu, pada konsentrasi tinggi, bentuk teroksidasi mengalami dimerisasi, yang mengubah spektrum dan kinetika tampak tanpa mengubah pasangan dasarnya. Kedua fakta tersebut tidak menghilangkan reversibilitas. Keduanya menjelaskan pengamatan yang jika tidak demikian dapat terlihat seperti irreversibilitas.

Kerabat terdemetilasi menggeser skala

Hilangkan gugus metil dari kedua lengan dimetilamino dan pasangan tersebut tetap bertahan dengan sifat yang bergeser. Maksimum absorpsi bergeser secara monoton ke arah panjang gelombang yang lebih pendek pada setiap demetilasi: metilena biru di sekitar 664 nm, Azure B di sekitar 654, Azure A di sekitar 630, Azure C di sekitar 615, dan tionina di sekitar 600 nm. Azure B, yang kehilangan satu gugus metil, adalah kerabat terdekat: metabolit utama metilena biru dan pengotor yang terdokumentasi dalam bahan metilena biru. Azure A dan Azure C melanjutkan seri dengan kerangka aktif-redoks yang sama. Tionina, dengan kedua gugus amino terdemetilasi sepenuhnya, berada di ujung seri dengan potensial formal di sekitar +0.06 V pada pH 7 dibandingkan dengan metilena biru pada +0.011 V, sehingga secara berarti lebih mudah direduksi. Potensial redoks di seluruh seri bergantung pada medium dan elektroda, jadi bandingkan nilainya hanya dalam satu rangkaian kondisi yang sama. Inilah sebabnya profil pengotor merupakan persoalan redoks, bukan sekadar kotak centang kemurnian. Beberapa persen Azure B berarti beberapa persen pasangan redoks yang berbeda di dalam botol, dan Azure B sebagai pengotor dan metabolit menjelaskan bagaimana fraksi tersebut dikendalikan.

Tempat biologi terhubung

Di dalam sel darah merah, NADPH mereduksi metilena biru menjadi leukometilena biru, dan bentuk leuko meneruskan elektron ke besi heme feri, sehingga mengembalikan keadaan fero hemoglobin. Relai elektron tunggal tersebut merupakan dasar kimia penggunaan metilena biru pada methemoglobinemia didapat. Semua yang terjadi setelah relai tersebut, metabolisme energi, aliran elektron mitokondria, dan hasil biologis apa pun, termasuk dalam pembahasan transport elektron mitokondria dan sengaja dibiarkan di sana.

Beli pasangannya, bukan hanya warnanya

Pewarna redoks hanya sebaik spesifikasinya. Kemurnian tinggi penting karena metilena biru non-USP biasanya merupakan grade tekstil, yang membawa Azure B, logam berat, atau pelarut residu yang menggeser pembacaan redoks dan mengaburkan titik akhir yang tidak diperiksa oleh protokol pewarnaan. Sebagian besar penjual yang mengklaim kesesuaian dengan USP hanya menguji logam berat lalu menganggap pekerjaannya selesai. Kesesuaian penuh mencakup identitas, kadar, pengotor organik, pelarut residu, pengotor unsur, residu pemijaran, batas mikroba, dan endotoksin bakteri, dan cara memilih metilena biru grade farmasi menjelaskan cara membaca dokumentasi tersebut. Blupreme bekerja dengan produsen farmasi metilena biru, menguji seluruh spesifikasi USP, dan memublikasikan COA lengkap. Ketika warna menjadi pengukuran, dokumentasi tersebut merupakan bagian dari instrumen. :::