Metilen biru dan ferroptosis: mekanisme peroksidasi lipid

Ferroptosis adalah kematian sel akibat kerusakan membran. Lemak tak jenuh ganda dalam membran teroksidasi melalui reaksi berantai, membran gagal berfungsi, dan sel mati. Besi diperlukan untuk reaksi kimia tersebut. Kalimat itu merangkum seluruh konsepnya, dan semua hal dalam artikel ini merupakan pengujian terhadap salah satu bagiannya.

Pertanyaan di sini lebih sempit: apa yang dilakukan metilen biru terhadap rantai tersebut dalam eksperimen sel, dan apa yang sebenarnya ditunjukkan oleh hasilnya. Jawaban singkatnya adalah bahwa dalam dua studi laboratorium, metilen biru pada konsentrasi nanomolar mengurangi peroksidasi lipid mitokondria dan mempertahankan kelangsungan hidup sel setelah pemicu yang sebaliknya menyebabkan ferroptosis. Jawaban yang lebih panjang lebih penting, karena setiap mata rantai diuji dengan intervensi yang berbeda, dan setiap intervensi memiliki keterbatasan.

Ferroptosis dalam satu paragraf

Fosfolipid membran yang membawa ekor asam lemak tak jenuh ganda memiliki titik lemah: atom hidrogen yang mudah diambil. Setelah suatu radikal mengambil salah satunya, oksigen berikatan dengan lipid, terbentuk radikal peroksil lipid, lalu radikal tersebut mengambil hidrogen dari lipid berikutnya. Reaksi ini merambat di sepanjang membran kecuali ada sesuatu yang menghentikannya.

Sinyal penghenti utama adalah enzim bernama GPX4, yang menggunakan glutation untuk mereduksi peroksida lipid menjadi alkohol lipid yang tidak berbahaya. Pemicu laboratorium menyerang pertahanan ini pada titik-titik yang telah ditentukan. Erastin menghambat impor sistin melalui sistem xc-minus, sehingga sel kekurangan sistein untuk sintesis glutation. Buthionine sulfoximine secara langsung menghambat sintesis glutation. RSL3 menghambat GPX4 itu sendiri. Ketiganya membuat peroksida tidak tersingkirkan, tetapi melakukannya pada tahapan yang berbeda, sehingga hasil dengan satu pemicu tidak otomatis berlaku untuk pemicu lainnya.

Ferroptosis berbeda dari apoptosis berdasarkan sifat-sifat yang mendefinisikannya. Tidak ada kaskade kaspase dan tidak ada badan apoptotik. Pengkelat besi seperti deferoxamine dan agen penangkap radikal seperti ferrostatin-1 menekannya, yang menjadi uji operasional yang digunakan peneliti untuk menyebut suatu kematian sebagai ferroptotik, bukan sekadar nekrotik. Gambaran yang lebih luas tentang jalur kematian sel terregulasi menempatkan perbedaan ini dalam konteks, dan cara sel menangani besi labil menjelaskan mengapa pengkelatan menjadi kontrol yang begitu menentukan.

Peran mitokondria, dan mengapa hal itu diperdebatkan

Penelitian awal melaporkan bahwa sel tanpa DNA mitokondria tetap mengalami ferroptosis, yang menunjukkan bahwa mitokondria mungkin tidak wajib terlibat. Penelitian berikutnya menemukan bahwa mengurangi mitokondria, atau menghambat respirasi, dapat menekan ferroptosis akibat kekurangan sistein tetapi tidak akibat penghambatan GPX4 secara langsung. Kedua hasil tersebut dapat sama-sama benar jika kontribusi mitokondria bergantung pada pemicu, jenis sel, dan lokasi terjadinya peroksidasi yang menentukan.

Studi yang menjadi dasar artikel ini mendekati perdebatan tersebut dengan probe yang spesifik terhadap kompartemen. MitoCLox adalah versi reporter peroksidasi lipid yang ditargetkan ke mitokondria: fluoresensinya bergeser ketika bertemu radikal peroksil lipid di dalam mitokondria. Pada fibroblas yang diberi erastin, oksidasi probe mitokondria muncul pada sel yang masih hidup sebelum kematian dan bersifat heterogen di seluruh populasi. Urutan waktu tersebut penting. Peroksidasi yang mendahului kematian merupakan kandidat penyebab. Peroksidasi yang hanya diukur pada sel mati adalah sisa kerusakan. Panduan pendamping tentang uji peroksidasi lipid dan apa yang dilaporkan oleh setiap probe membahas mengapa lokasi probe menentukan arti suatu sinyal.

Pola yang sama muncul pada model kedua. Fibroblas dari seorang pasien dengan neuropati optik herediter Leber, yang membawa mutasi kompleks I dan memiliki stres oksidatif dasar yang lebih tinggi, mati melalui ferroptosis ketika glutation dikurangi, sedangkan fibroblas kontrol bertahan. Oksidasi probe mitokondria kembali terjadi lebih dahulu. Detailnya tersedia dalam studi fibroblas tentang peroksidasi lipid mitokondria pada ferroptosis.

Apa yang diubah metilen biru dalam eksperimen ini

Metilen biru adalah pembawa redoks. Bentuk teroksidasinya menerima elektron dari reaksi yang terkait NADH pada kompleks I, sedangkan bentuk tereduksinya mendonasikannya ke sitokrom c, yang memasok kompleks IV. Hal ini menciptakan jalur pintas parsial di sekitar segmen rantai tempat elektron biasanya bocor ke oksigen sebagai superoksida. Pembaca yang menginginkan gambaran lengkap tentang aliran ini sebaiknya memulai dari bagaimana metilen biru memindahkan elektron melalui mitokondria.

Pada fibroblas paru yang diberi erastin, metilen biru pada 250 nanomolar mempertahankan viabilitas dalam pengukuran kelangsungan hidup sel, bersama antioksidan yang ditargetkan ke mitokondria, SkQ1 dan MitoTEMPO. Kontrol menentukan batas klaim tersebut. Ferrostatin-1, alpha-tocopherol, dan deferoxamine juga memberikan perlindungan, yang mengonfirmasi bahwa kematian tersebut bersifat ferroptotik. Analog SkQ1 tanpa gugus antioksidan tidak memberikan perlindungan, yang menunjuk pada kimia redoks, bukan akumulasi nonspesifik. Perlindungan menurun di atas sekitar 200 nanomolar SkQ1, sejalan dengan perilaku pro-oksidan antioksidan kuinon yang telah diketahui pada beban lebih tinggi. Metilen biru memiliki perilaku dosis bermuka dua yang sama, bersifat protektif pada kadar nanomolar rendah dalam kultur ini dan mampu menghasilkan hidrogen peroksida melalui siklus redoks ketika konsentrasinya dinaikkan atau terkena cahaya kuat. Konteks dosis seperti ini dibahas dalam spesies oksigen reaktif di mitokondria.

Eksperimen pada mitokondria terisolasi kemudian memisahkan sumber ROS. Dengan adanya besi fero, substrat yang memasok kompleks I ditambah rotenone merangsang oksidasi probe. Rotenone menghambat bagian hilir dari situs flavin, sehingga pembawa di bagian hulu tetap dalam keadaan tereduksi dan membocorkan elektron ke oksigen dari flavin yang menghadap matriks. Substrat yang memasok kompleks III ditambah antimycin A menghasilkan hidrogen peroksida dalam jumlah besar tetapi tidak mendorong peroksidasi lipid. Sinyal ROS total yang sama, lokasi berbeda, hasil berbeda. SkQ1 dan metilen biru masing-masing menekan peroksidasi yang digerakkan kompleks I tanpa menekan produksi hidrogen peroksida itu sendiri, yang menempatkan aksi keduanya setelah pembentukan ROS, pada tahap peroksidasi lipid.

Bagian kelebihan besi dan petunjuk lipofuscin

Studi kedua mengajukan pertanyaan dari sisi besi. Kardiomiosit H9c2 yang terpapar ferric ammonium citrate pada kadar submillimolar mengalami ROS mitokondria, peroksidasi lipid mitokondria, kemudian ferroptosis, diikuti oleh akumulasi pigmen menyerupai lipofuscin dalam waktu 24 hours. Lipofuscin adalah residu autofluoresen yang mengandung besi dari lipid dan protein teroksidasi yang terakumulasi seiring bertambahnya usia, dan kemunculannya yang cepat di sini menghubungkan peroksidasi akut yang didorong besi dengan penanda klasik penuaan. Metilen biru dan SkQ1 pada konsentrasi nanomolar masing-masing mencegah peroksidasi, kematian, dan akumulasi pigmen tersebut. Mitokondria jantung terisolasi mengonfirmasi pola ini: rotenone ditambah besi fero mendorong peroksidasi dan sinyal menyerupai pigmen, dan kedua agen tersebut menghambatnya. Urutan lengkapnya dilaporkan dalam studi kelebihan besi pada kardiomiosit H9c2. Bagian tentang pigmen ini berkaitan dengan lipofuscin dan penanda penuaan seluler.

Apa yang tidak ditunjukkan oleh uji kelangsungan hidup sel

Pengukuran viabilitas seperti CellTiterBlue menunjukkan berapa banyak sel dalam kultur yang tetap aktif secara metabolik setelah diberi pemicu dan kandidat pelindung. Itu adalah pengujian suatu mekanisme dalam sistem yang terdefinisi. Itu bukan hasil pengobatan. Tidak satu pun dari eksperimen ini memberikan dosis kepada pasien, mengukur endpoint penyakit, atau menetapkan jendela terapeutik dalam tubuh.

Empat keterbatasan perlu dinyatakan secara eksplisit. Pertama, jenis selnya terbatas: fibroblas paru tertransformasi, fibroblas kulit primer termasuk satu garis sel penyakit mitokondria, dan satu garis kardiomiosit tikus, ditambah mitokondria jantung tikus terisolasi. Sensitivitas berbeda menurut garis sel, dan garis LHON memang dirancang sebagai model yang sangat rentan. Kedua, pemicunya merupakan kondisi laboratorium yang ekstrem: penghambatan transport secara penuh atau penghambatan sintesis, serta beban besi yang tidak akan dialami jaringan secara akut. Ketiga, konsentrasi tidak dapat diterjemahkan dengan sekadar perkalian. Konsentrasi nanomolar dalam medium kultur bukanlah dosis manusia, dan distribusi metilen biru, reduksinya menjadi bentuk tak berwarna dalam darah dan jaringan, paparan cahaya, serta potensial membran semuanya menjadi faktor antara kultur dan manusia. Keempat, probe hanya melaporkan kompartemennya sendiri. Oksidasi MitoCLox menunjukkan terbentuknya radikal lipid mitokondria; hal itu tidak menunjukkan bahwa ruptur membran plasma, yang kemungkinan merupakan peristiwa terminal, dicegah secara langsung alih-alih dihindari lebih awal di jalur tersebut.

Jadi, klaim yang tepat adalah sebagai berikut: dalam model-model ini, ROS yang berasal dari kompleks I bersama besi mendorong peroksidasi lipid mitokondria yang mendahului ferroptosis, dan metilen biru pada konsentrasi rendah memutus segmen tersebut. Apa pun yang melampaui segmen itu memerlukan eksperimen berbeda pada hewan dan kemudian pada manusia.