Methylene blue untuk cedera otak: memahami bukti praklinis

Benturan pada kepala, arteri yang tersumbat, dan penyakit neurodegeneratif yang berkembang perlahan semuanya dapat berujung pada keluhan yang sama: otak tidak lagi memiliki energi untuk menjalankan fungsinya. Titik akhir yang sama inilah yang membuat satu senyawa terus muncul dalam ketiga literatur tersebut. Namun, titik akhir yang sama bukan berarti konsepnya sama. Perlakuan yang diberikan sebelum cedera, perlakuan yang diberikan dalam satu jam setelah cedera, dan perlakuan yang dinilai beberapa bulan kemudian menguji gagasan yang berbeda, meskipun jarum suntiknya berisi cairan biru yang sama.

Artikel ini membahas bagian literatur yang berkaitan dengan cedera. Artikel ini meninjau apa arti methylene blue untuk cedera otak dalam eksperimen pada hewan, memisahkan cedera traumatis dari stroke dan dari neurodegenerasi kronis, serta menunjukkan mengapa waktu pemberian dosis menjelaskan sebagian besar perbedaan antarstudi.

Tiga jenis cedera, satu kegagalan energi

Mekanisme yang menghubungkan model-model ini berada di dalam mitokondria. Dalam kondisi normal, elektron bergerak sepanjang rantai transpor elektron untuk menghasilkan ATP, dan rantai yang sehat menjaga spesies oksigen reaktif tetap terkendali. Setelah cedera, sebagian rantai terganggu, produksi ATP menurun, dan produksi radikal bebas meningkat. Ulasan Molecular Neurobiology tahun 2018 menjelaskan methylene blue sebagai pembawa elektron alternatif: senyawa ini menerima elektron dari NADH dan meneruskannya ke sitokrom c, yang meningkatkan aktivitas kompleks IV dan memulihkan sintesis ATP bahkan ketika bagian awal rantai mengalami gangguan.

Angka yang dilaporkan cukup konkret. Dalam preparat sel dan irisan jaringan, aktivitas kompleks IV meningkat 30 hingga 100 persen sementara konsumsi oksigen meningkat seiring dengannya, yang menunjukkan bahwa elektron tambahan tersebut melakukan kerja yang berguna alih-alih bocor sebagai radikal. Dalam model stroke pada tikus, produksi ATP di wilayah yang terdampak sekitar 30 persen lebih tinggi 24 jam setelah perlakuan dibandingkan pada hewan yang tidak mendapat perlakuan. Ulasan Biochemistry (Moscow) tahun 2022 menambahkan konsekuensi hilirnya: lebih sedikit stres oksidatif, lebih sedikit neuroinflamasi, lebih sedikit apoptosis, serta efek pada monoamine oxidase, nitric oxide synthase, biogenesis mitokondria, autofagi, dan agregasi protein yang salah lipat.

Jadi konsepnya sederhana. Cedera menghambat jalur normal elektron, dan methylene blue menyediakan jalur alternatif. Selanjutnya, semuanya bergantung pada jenis cedera, kapan diberikan, dan bagaimana hasilnya diukur.

Cedera traumatis bukanlah stroke

Dalam model cedera otak traumatis, gaya datang sekaligus. Kerusakan primer bersifat mekanis: jaringan robek, pembuluh darah pecah, dan sawar darah-otak terbuka dalam hitungan menit. Hal yang secara masuk akal dapat dipengaruhi methylene blue adalah gelombang sekunder yang menyusul selama beberapa jam dan hari, ketika mitokondria dalam jaringan yang masih bertahan mengalami kegagalan, inflamasi menyebar, dan edema berkembang. Titik akhir dalam studi-studi ini mencerminkan urutan tersebut: volume lesi, kandungan air otak, kelangsungan hidup neuron di dekat lokasi benturan, dan kemudian perilaku seperti pemulihan motorik atau pembelajaran dalam labirin.

Dalam model stroke atau iskemia global, bentuk insultnya berlawanan. Aliran darah berhenti, kegagalan energi menyusul dalam hitungan menit, dan pemulihan aliran darah membawa cedera reperfusinya sendiri. Di sini, pemberian dosis diselaraskan dengan kejadian pada pembuluh darah, sering kali dalam hitungan menit setelah oklusi atau reperfusi, dan titik akhirnya mengukur nasib jaringan akut selama beberapa jam hingga satu atau dua hari: ukuran infark, aliran darah, dan pemulihan fungsi awal. Salah satu pola dalam literatur stroke adalah praperlakuan, yaitu hewan diberi dosis sebelum oklusi pembuluh darah, yang menguji pencegahan dengan cara yang secara etis tidak dapat ditiru oleh eksperimen trauma kepala pada manusia.

Hasil pada stroke adalah yang paling kuat dalam literatur cedera, dan mencakup hasil nol yang paling jelas. Tikus yang diberi methylene blue saat reperfusi setelah satu jam oklusi middle cerebral artery berakhir dengan infark 30 persen lebih kecil pada hari ke-2, dengan lebih banyak bagian inti yang terancam dan penumbra berhasil dipertahankan (Shen, 2013). Studi oklusi permanen menemukan perkembangan jaringan yang terancam menjadi infark berlangsung lebih lambat, tetapi tidak ada penurunan volume akhir infark pada 24 jam pada kedua dosis yang diuji (Rodriguez, 2014). Studi oklusi ketiga mengurangi ukuran infark kira-kira menjadi setengah pada dosis menengah dan secara langsung mendokumentasikan ultrastruktur mitokondria serta mitofagi di otak yang mengalami iskemia, sekaligus melaporkan detail yang berlawanan dengan intuisi bahwa apoptosis yang terukur meningkat ketika nekrosis menurun (Di, 2015). Dan pada iskemia global, infus dosis rendah secara kontinu memulihkan aktivitas cytochrome c oxidase, kadar ATP, dan potensial membran mitokondria di wilayah hippocampal CA1 yang rentan, mempertahankan neuron-neuron tersebut, dan melindungi memori spasial (Lu, 2016). Pengukuran CA1 tersebut layak diperhatikan: data langsung ATP dan rantai respirasi dari dalam otak yang mengalami cedera, sesuatu yang sebagian besar hanya disimpulkan, bukan diukur, dalam literatur TBI.

Neurodegenerasi kronis berbeda dari keduanya. Model penyakit Alzheimer, Parkinson, dan Huntington memberikan dosis kepada hewan selama berminggu-minggu atau berbulan-bulan dan mengukur agregasi protein, pengelolaan dopamin, atau penurunan kognitif secara bertahap. Titik-titik akhir tersebut hampir tidak memiliki kesamaan dengan lesi yang diukur beberapa hari setelah benturan. Pembaca yang memindahkan hasil dari satu kolom ke kolom lain berarti membawa suatu temuan melintasi batas yang tidak pernah dilintasi oleh eksperimen itu sendiri. Panduan kami mengenai literatur neurodegenerasi mempertahankan studi dengan rentang waktu panjang tersebut dalam kerangkanya sendiri, dan perbandingan dengan bukti khusus stroke memisahkan secara terperinci desain penyumbatan pembuluh darah dari desain benturan.

Apa yang sebenarnya dilakukan oleh model TBI

Belum ada uji coba methylene blue pada manusia untuk cedera otak traumatis yang dipublikasikan. Seluruh rekam bukti TBI berasal dari penelitian pada hewan, terutama tikus dan mencit, dan terkonsentrasi pada sejumlah kecil eksperimen yang layak disebutkan satu per satu karena detailnya berbeda dengan cara yang sering dihilangkan oleh ringkasan.

Studi controlled cortical impact paling awal memberikan 1 mg/kg secara intravena kepada tikus satu jam setelah benturan ringan, kemudian 0.5 mg/kg pada tiga jam (Watts, 2014). Volume lesi pada MRI tetap lebih rendah pada hewan yang mendapat perlakuan selama dua minggu masa tindak lanjut. Kesalahan langkah dalam tes berjalan menurun secara signifikan pada hari ke-1, 2, dan 7 tetapi tidak pada hari ke-14. Pada pemeriksaan mikroskopis hari ke-14, neuron yang mengalami degenerasi di korteks yang cedera berjumlah 270 versus 368 per bidang pandang, dan pewarnaan Nissl abnormal 41 versus 73. Dengan kata lain, terdapat perlindungan awal, dengan keunggulan perilaku yang memudar pada minggu kedua.

Desain cedera difus menggunakan midline fluid percussion pada mencit dan satu dosis intravena 2 mg/kg dalam waktu setengah jam (Fenn, 2015). Hewan yang mendapat perlakuan menunjukkan ekspresi gen inflamasi yang lebih tenang, lebih sedikit mikroglia inflamatorik, edema yang tampak lebih ringan, dan tidak menunjukkan perilaku menyerupai depresi pada hari ke-7. Hasil nolnya sama pentingnya: cedera itu sendiri hanya meningkatkan kandungan air otak secara ringan, dan methylene blue tidak memulihkan penurunan berat badan atau defisit koordinasi motorik. Efek anti-inflamasi tidak sama dengan perlindungan penuh.

Dua studi pada mencit menggunakan jadwal yang sama, 1 mg/kg pada satu jam, 0.5 mg/kg pada enam jam, kemudian pemberian dosis harian selama tiga hari, dan memperluas pembahasan mekanismenya. Dalam model cortical impact, perlakuan memperkecil volume lesi pada 24 jam, 72 jam, dan hari ke-14 sambil mempertahankan neuron dan meningkatkan penanda autofagi (Zhao, 2016). Dalam model fluid percussion, perlakuan mengurangi apoptosis neuron, memperbaiki sawar darah-otak yang bocor, dan meningkatkan skor neurologis selama dua minggu (Shen, 2019). Namun, kandungan air otak tidak menunjukkan perbedaan pada 72 jam dalam studi Zhao, dan performa rotarod tidak menunjukkan perbedaan pada hari ke-1 dan 3 dalam studi Shen. Titik akhir berupa lesi dan kelangsungan hidup sel berubah; pembengkakan dan titik akhir motorik awal tidak selalu mengikuti.

Eksperimen pemberian dosis tertunda merupakan yang paling menonjol dari sisi waktu (Watts, 2016). Dengan menggunakan model benturan yang sama, dosis pertama baru diberikan 24 jam setelah cedera. Pada hari ke-2, kelompok dengan pemberian tertunda menunjukkan pengurangan lesi yang sebanding dengan hewan yang mendapat perlakuan pada jam-jam pertama, dan pengurangan tersebut bertahan pada hari ke-7 dan 14. Sinyal perilakunya lebih lemah: perbaikan kesalahan langkah pada kelompok tertunda hanya berupa tren yang tidak signifikan. Satu laboratorium, satu model, satu jendela 24 jam. Ini merupakan bukti nyata bahwa jendela tersebut melampaui jam-jam pertama, tetapi juga merupakan seluruh bukti yang ada untuk proposisi tersebut. Perhatikan jebakan pada kata tertunda di tempat lain: sebuah seri penelitian Rusia yang judulnya membahas neuroproteksi tertunda memberikan dosis pada 30 menit dan menggunakan istilah tertunda untuk berarti hasil yang bertahan lama, bukan inisiasi yang terlambat.

Sebuah studi cedera fokal yang lebih kecil pada tikus melengkapi gambaran waktu dari arah sebaliknya: pemberian dosis tepat sebelum cedera dan pemberian dosis 30 menit setelahnya sama-sama mengurangi disfungsi anggota gerak (Stelmashook, 2019). Praperlakuan bekerja di laboratorium justru karena laboratorium menjadwalkan cedera.

Disiplin dosis penting di sini. Ulasan menggambarkan dosis rendah sebagai stimulatif terhadap respirasi mitokondria dan dosis tinggi sebagai inhibitorik, pola bifasik yang sama seperti yang terlihat di seluruh farmakologi methylene blue. Karena itu, hasil tidak dapat dibaca sebagai semakin banyak methylene blue, semakin besar pemulihan. Setiap studi menguji satu titik pada suatu kurva. Penjelasan respons dosis menelusuri kurva tersebut di berbagai model, dan profil keamanan dan efek samping membahas apa yang terjadi pada dosis yang lebih tinggi.

Baca tabel tersebut dari kiri ke kanan: senyawa yang sama, tiga rentang waktu yang berbeda. Pencegahan termasuk dalam baris tengah, perlakuan segera termasuk dalam dua baris pertama, dan hasil tertunda termasuk dalam baris pertama dan ketiga.

Pencegahan, perlakuan segera, hasil tertunda

Pencegahan adalah klaim yang paling mudah disalahpahami. Dalam model iskemia, hewan yang diberi dosis sebelum oklusi pembuluh darah menunjukkan hasil yang lebih baik, dan hasil tersebut kadang dikutip seolah-olah methylene blue melindungi otak apa pun dari cedera apa pun di masa mendatang. Hasil itu tidak menunjukkan hal tersebut. Hasil itu menunjukkan bahwa mitokondria yang telah dipersiapkan dengan jalur elektron alternatif lebih mampu menoleransi hilangnya aliran darah yang dijadwalkan. Tidak ada yang menjadwalkan cedera kepala.

Perlakuan segera adalah tempat bukti TBI paling terkonsentrasi. Pemberian dosis dalam beberapa jam setelah benturan menargetkan rangkaian cedera sekunder ketika proses tersebut masih berlangsung: kegagalan energi, stres oksidatif, inflamasi, dan pembengkakan. Titik akhir berupa lesi dan edema yang membaik dalam kondisi ini merupakan efek perlakuan yang nyata, tetapi yang ditangani adalah suatu proses, bukan pembalikan jaringan yang telah robek.

Hasil tertunda adalah konsep ketiga. Perilaku yang diukur beberapa minggu setelah cedera, atau pengelolaan protein yang diukur beberapa bulan setelah dimulainya model degeneratif, menjawab apakah perlindungan awal bertahan atau apakah proses yang lambat berubah arah. Lesi yang lebih kecil pada 24 jam, tren perilaku yang tidak signifikan setelah dosis pertama yang tertunda 24 jam, dan perbaikan performa labirin setelah berbulan-bulan pemberian dosis kronis merupakan tiga klaim berbeda dengan tiga beban pembuktian berbeda, dan saat ini hanya yang pertama yang melampaui ambang tersebut lebih dari sekali.

Apa yang tidak dapat ditunjukkan oleh bukti ini

Setiap hasil di atas memiliki batasan yang sama. Mitokondria hewan pengerat merespons methylene blue dengan cara yang mungkin juga dimiliki mitokondria manusia, tetapi tikus yang diberi dosis intravena beberapa menit setelah benturan terkalibrasi bukanlah manusia yang tiba di unit gawat darurat beberapa jam setelah jatuh. Anestesi, tingkat keparahan cedera yang dikendalikan, hewan muda yang sehat, dan masa tindak lanjut yang singkat semuanya membatasi apa yang dapat diterapkan. Sama sekali belum ada studi methylene blue pada cedera akibat ledakan, sehingga jenis cedera yang paling relevan bagi pembaca dari kalangan militer justru memiliki bukti paling sedikit.

Tidak ada pula konversi dosis yang dapat ditawarkan. Literatur pada hewan menggunakan rute intravena dan intraperitoneal dengan dosis yang dipilih untuk pengendalian eksperimental, bukan tetes oral yang dijual secara ritel. Tidak ada satu pun dari studi ini yang menetapkan regimen untuk manusia, dan tidak ada yang menguji methylene blue bersama penanganan standar cedera kepala.

Jadi ringkasan yang sesuai dengan bukti dapat dimuat dalam satu paragraf. Pada hewan pengerat, methylene blue yang diberikan sekitar waktu terjadinya cedera otak traumatis atau iskemik mempertahankan produksi energi mitokondria, dan pemeliharaan tersebut diikuti oleh lesi yang lebih kecil serta skor pemulihan yang lebih baik. Satu studi benturan mempertahankan sebagian efek terhadap lesi meskipun dosis pertama ditunda 24 jam. Apakah hal ini juga terjadi pada otak manusia yang mengalami cedera belum pernah diuji, dan literatur TBI serta stroke menguji waktu pemberian yang berbeda terhadap titik akhir yang berbeda. Siapa pun yang menjual kepastian berdasarkan bukti ini sedang menambahkan unsur yang tidak pernah ada dalam eksperimen tersebut. :::