Dapatkah metilen biru melewati Kompleks III mitokondria? Mengapa hasil studi berbeda

Dua laboratorium meneliti apakah metilen biru dapat melewati Kompleks III mitokondria yang terblokir. Satu menjawab tidak. Yang lain menjawab ya. Keduanya memiliki data.

Studi pertama, pada mitokondria otak mencit, menemukan bahwa zat warna tersebut tidak dapat melakukannya. Studi kedua, pada mitokondria otak dari tiga spesies hewan pengerat, menemukan bahwa zat warna tersebut sebagian dapat melakukannya. Studi ketiga, pada hati mencit, sering dikutip dalam konteks yang sama tetapi sebenarnya menguji hal lain. Tempatkan studi itu pada konteksnya, dan separuh kebingungan akan hilang.

Tidak ada satu mekanisme universal yang dapat dinyatakan. Ada tiga eksperimen dengan penghambat, dosis, dan keluaran pengukuran yang berbeda. Baca kondisinya terlebih dahulu. Kesimpulannya akan mengikuti.

Apa arti bypass dalam konteks ini

Elektron memasuki rantai melalui Kompleks I (dari NADH) atau Kompleks II (dari suksinat), melewati Kompleks III menuju sitokrom c, lalu melalui Kompleks IV menuju oksigen. Gradien yang terbentuk sepanjang proses inilah yang digunakan sel untuk membuat ATP.

Klaim bypass berarti metilen biru mengambil elektron di sisi hulu dari suatu blok dan menyerahkannya kembali di sisi hilir. Zat warna teroksidasi menerima elektron dari NADH atau komponen awal rantai, lalu menjadi leucomethylene blue, dan bentuk tereduksi menyerahkan elektron tersebut kepada sitokrom c atau kembali ke dalam rantai. Jika penyerahan terjadi di hilir blok, respirasi dan potensial membran sebagian pulih. Jika terjadi pada atau di hulu blok, tidak ada pemulihan.

Satu detail mengenai Kompleks III menentukan sebagian besar perdebatan ini. Kompleks tersebut menjalankan siklus Q dengan dua lokasi inhibitor. Antimycin berikatan dengan lokasi Qi. Myxothiazol berikatan dengan lokasi Qo. Studi yang hanya menggunakan salah satunya hanya menguji separuh kompleks.

Studi pertama: tidak ada bypass pada mitokondria otak mencit

Gureev dan rekan menggunakan mitokondria korteks dari mencit C57BL/6, diisolasi dengan digitonin, dan diuji pada 0.1 mg protein per ml. Substrat mencakup tiga kondisi: pyruvate plus malate masing-masing pada 5 mM, succinate pada 10 mM dengan glutamate pada 2 mM, dan L-proline pada 10 mM. Penghambatnya adalah rotenone pada 1 micromolar (Kompleks I) dan antimycin pada 1 microgram per ml (Kompleks III). Dosis zat warna adalah 0.5, 1, dan 2 micromolar, dengan 1 micromolar sebagai konsentrasi utama. Metode dan kurva tersedia dalam komunikasi FEBS Letters.

Bypass Kompleks I berhasil. Rotenone menurunkan respirasi yang distimulasi ADP dari sekitar 121 menjadi sekitar 2 nmol per minute per mg, dan 1 micromolar zat warna memulihkannya menjadi sekitar 21. Potensial membran pulih pada pyruvate plus malate dan pada L-proline.

Bypass Kompleks III tidak berhasil. Antimycin menurunkan respirasi menjadi sekitar 16, dan zat warna hanya menaikkannya menjadi sekitar 20. Potensial membran tidak pulih pada substrat mana pun, pada dosis zat warna hingga 5 micromolar. Data peroksida mengarah pada kesimpulan yang sama: zat warna saja meningkatkan emisi peroksida dari laju basal sekitar 76 pmol per minute per mg menjadi kira-kira 1170, 1460, dan 1945 pada ketiga dosis, tetapi antimycin menurunkan sinyal yang digerakkan zat warna tersebut masing-masing sekitar 25, 88, dan 96 persen. Jika zat warna tereduksi bereaksi langsung dengan oksigen, pemblokiran Kompleks III seharusnya tidak menekan sinyal tersebut. Para penulis menyimpulkan bahwa zat warna tereduksi dioksidasi pada lokasi Qo Kompleks III, di hulu blok antimycin. Jalur pendeknya, dalam kata-kata: donor ke zat warna, zat warna ke Qo, lalu jalur normal berlanjut. Rotenone dilewati. Antimycin tidak.

Studi kedua: bypass parsial pada tiga spesies, di kedua lokasi inhibitor

Svab dan rekan memperluas rancangan eksperimen. Mitokondria otak dari mencit, tikus, dan marmut, diisolasi dengan Percoll, diuji pada 0.1 mg per ml yang sama, menggunakan pyruvate plus malate atau glutamate plus malate masing-masing pada 5 mM. Mereka menggunakan dua penghambat Kompleks III: antimycin A pada 0.3 micromolar dan myxothiazol pada 1 micromolar. Zat warna digunakan pada 2 micromolar dalam sebagian besar pengujian, dan 0.5 dalam pengujian sitokrom c. Ketiga spesies dengan protokol yang disamakan dilaporkan dalam makalah akses terbuka.

Kedua jenis blok sebagian dapat dilewati pada ketiga spesies. Pada mitokondria mencit, antimycin menekan respirasi dan zat warna menaikkannya sekitar 60 persen, dari kira-kira 37 menjadi 59 nmol per minute per mg. Myxothiazol menekannya 88 persen, menjadi sekitar 4.5, dan zat warna menaikkannya lima kali lipat menjadi sekitar 23. Potensial membran sebagian mengalami repolarisasi pada kedua inhibitor, diukur menggunakan dua zat warna (safranin O dan TMRM ratiometrik) untuk menyingkirkan artefak optik.

Makalah ini juga menguji penyerahan elektron secara langsung, sesuatu yang tidak pernah dilakukan dalam studi pertama. Sitokrom c terasetilasi eksogen pada 25 micromolar tidak direduksi oleh mitokondria yang diberi energi, baik dengan maupun tanpa inhibitor, tetapi penambahan zat warna mendorong reduksi pada kedua kondisi. Dalam buffer bebas sel, NADH plus zat warna mereduksi sitokrom c pada laju yang sebanding dengan NADH. Jalur yang lebih panjang, dalam kata-kata: ekuivalen pereduksi ke zat warna, zat warna langsung ke sitokrom c, Kompleks IV ke oksigen. Jalur tersebut sepenuhnya melewati Kompleks III, sehingga kedua penghambat dapat dilewati.

Dua keluaran tambahan mendukung interpretasi tersebut. Fluoresensi NAD(P)H menurun ketika zat warna ditambahkan ke mitokondria yang diberi myxothiazol, yang berarti ekuivalen pereduksi mengalir melalui jalur baru. Selain itu, absorbansi zat warna pada 660 nm mengikuti setiap penambahan secara berurutan, sementara supernatan setelah sentrifugasi menunjukkan bahwa zat warna teroksidasi diperkaya lebih dari seratus kali lipat di dalam mitokondria yang diberi energi, lalu keluar ketika potensial runtuh. Perhitungan proton juga sesuai: melewati tahapan pemompaan menyisakan kira-kira 2 proton per pasangan elektron, bukan 10, sehingga penggunaan oksigen yang lebih cepat dengan hanya repolarisasi parsial adalah pola yang diharapkan dari bypass yang nyata, bukan bukti yang menentangnya.

Preparasi yang sama menghasilkan respons yang dapat menyesatkan pembacaan sepintas. Dengan inhibitor plus zat warna, ADP menurunkan respirasi alih-alih menaikkannya, dan pemblokiran transpor justru menstimulasi respirasi alih-alih memperlambatnya, sementara potensial membran tetap bergerak ke arah normal. Konsumsi oksigen saja menyesatkan dalam sistem ini.

Studi ketiga: studi hati yang menguji Kompleks I dan II, bukan III

Lee dan Boelsterli menggunakan mitokondria hati mencit dan hepatosit kultur yang mengalami cedera akibat efavirenz (Kompleks I, IC50 sekitar 30 micromolar) dan hydrazine, metabolit isoniazid (Kompleks II, IC50 sekitar 30 micromolar). Zat warna pada sekitar 30 micromolar memulihkan oksidasi NADH, potensial membran, dan ATP sambil menurunkan oksidan dan kematian nekrotik. Makalah Redox Biology memodelkannya sebagai zat warna yang membawa elektron mengitari Kompleks I dan II yang mengalami cedera.

Hasil tersebut merupakan konteks hulu yang telah mapan, dan tidak mengatakan apa pun tentang Kompleks III karena tidak ada pemblokiran pada kompleks tersebut. Studi ini tidak dapat mengonfirmasi maupun membantah kedua studi otak.

Matriks kondisi

Empat alasan kedua studi Kompleks III dapat sama-sama benar dalam kondisi eksperimennya masing-masing

1. Penghambatnya bukan intervensi yang sama. Antimycin saja pada 1 microgram per ml dibandingkan dengan antimycin pada 0.3 micromolar plus penghambat terpisah pada lokasi Qo. Jalur zat warna yang memasukkan elektron ke lokasi Qo gagal tepat pada kondisi ketika jalur langsung ke sitokrom c berhasil. Satu lokasi tidak dapat mewakili keduanya.

2. Dosis zat warna dan waktunya berbeda. Konsentrasi utama 1 dibandingkan dengan 2 micromolar, dalam sistem redox cycler yang penyerapan dan reduksi langsung sitokrom c-nya bergantung pada konsentrasi dan waktu. Perbedaan dosis kecil ditambah waktu pembacaan yang berbeda dapat memperlihatkan bagian yang berbeda dari jaringan yang sama.

3. Preparasinya berbeda. Isolasi dengan digitonin dibandingkan dengan isolasi gradien Percoll memilih populasi mitokondria yang saling tumpang tindih tetapi tidak identik. Konsentrasi protein sama pada 0.1 mg per ml, sehingga variabel tersebut tidak berperan, tetapi subpopulasi dan integritas tetap berbeda. Dugaan bahwa perbedaan berasal dari spesies juga tersingkir: kelompok kedua mereproduksi fenotipenya pada mencit.

4. Kondisi substrat menentukan apa yang dapat dilakukan zat warna. Tiga kondisi substrat dibandingkan dengan pasangan terkait NADH. Pasokan NADH dan potensial membran secara bersama-sama menentukan seberapa cepat zat warna direduksi dan di mana zat tersebut terdistribusi, dan jalur yang membutuhkan zat warna tereduksi di dekat sitokrom c teroksidasi sangat bergantung pada pilihan tersebut.

Cara membaca klaim bypass berikutnya

Tanyakan kompleks mana yang diblokir, dengan inhibitor apa, pada lokasi dan dosis berapa. Tanyakan konsentrasi zat warna dan kapan pembacaan dilakukan. Tanyakan jaringan, spesies, metode isolasi, konsentrasi protein, dan substrat. Dan tanyakan apakah potensial, respirasi, keadaan redoks, serta pengujian penyerahan elektron langsung memberikan hasil yang selaras, karena konsumsi oksigen saja lebih dari sekali menunjukkan arah yang keliru di sini.

Ringkasan sempitnya tetap berlaku. Bypass oleh zat warna di sekitar Kompleks I telah disepakati. Di sekitar Kompleks III, mitokondria mencit dengan antimycin pada 1 microgram per ml dan zat warna pada 1 micromolar tidak menunjukkan bypass fungsional, sedangkan tiga spesies dengan antimycin pada 0.3 micromolar atau myxothiazol pada 1 micromolar dan zat warna pada 2 micromolar menunjukkan bypass parsial dengan transfer langsung dari zat warna ke sitokrom c. Kedua pernyataan tersebut dapat benar secara bersamaan. Klaim yang lebih luas merupakan ekstrapolasi.

Bacaan terkait menempatkan klaim yang masih diperdebatkan ini di dalam kimia yang tidak diperdebatkan: cara metilen biru memindahkan elektron untuk mekanisme relainya, eksperimen bypass Kompleks I untuk kasus hulu yang telah mapan, pembacaan potensial membran dan artefaknya untuk alasan dua zat warna diperlukan, serta penanganan redox cycler di laboratorium untuk jebakan dosis dan waktu.