Artikel
Alternatif metilena biru untuk mikroskopi: pilih berdasarkan tugas
Untuk apusan bakteri sederhana, kristal violet dapat menggantikan metilena biru jika tujuannya adalah melihat bentuk sel. Untuk sel hidup, alternatif yang lebih baik mungkin berupa kontras fase tanpa pewarna sama sekali. Pilihannya bergantung pada pengamatan yang perlu Anda lakukan.
Misalkan dua orang sedang memeriksa kultur bakteri yang sama. Satu orang ingin membedakan sel berbentuk batang dari sel bulat. Orang lainnya ingin mengetahui apakah suatu perlakuan telah membunuh bakteri. Pewarna yang memberikan gambar jelas kepada orang pertama mungkin tidak memberikan jawaban yang dapat digunakan kepada orang kedua.
Sebelum memilih pengganti, lengkapi kalimat ini: “Saya perlu mengamati ___ pada ___, dan sel harus / tidak harus tetap hidup.” Kalimat tersebut menentukan tugas yang harus dilakukan oleh pewarna.
Mulailah dengan spesimen dan pertanyaannya
Pertama, tentukan apakah sel harus tetap hidup, lalu identifikasi fitur yang perlu Anda amati:
- Sel harus tetap hidup: untuk gerakan atau bentuk, pertimbangkan kontras fase tanpa pewarna atau DIC; untuk DNA inti, pertimbangkan Hoechst 33342 dengan fluoresensi; untuk integritas membran, pilih uji tervalidasi seperti SYTO 9 dengan propidium iodida.
- Sel tidak harus tetap hidup: untuk morfologi bakteri, pertimbangkan pewarnaan sederhana kristal violet atau pewarnaan negatif nigrosin; untuk reaksi Gram, gunakan metode pewarnaan Gram lengkap; untuk DNA inti pada sel terfiksasi, pertimbangkan fluoresensi DAPI.
Gunakan tabel ini untuk membandingkan keterbatasan setiap cabang. Ini adalah pilihan metode, bukan petunjuk untuk menukar botol reagen dalam protokol yang sudah ada.
| Apa yang perlu Anda amati | Spesimen dan peralatan | Kandidat alternatif | Keterbatasan utama |
|---|---|---|---|
| Bentuk dan susunan bakteri | Apusan bakteri yang telah disiapkan; brightfield | Pewarnaan sederhana kristal violet | Menunjukkan morfologi; tidak menentukan reaksi Gram atau viabilitas. |
| Garis luar sel dengan latar belakang gelap | Preparat bakteriologis; brightfield | Pewarnaan negatif nigrosin | Preparasi dan formulasi penting; sel yang tidak terwarnai belum tentu hidup. |
| Reaksi Gram | Apusan bakteri yang telah disiapkan; brightfield | Metode pewarnaan Gram lengkap | Memerlukan urutan reagen dan kontrol yang lengkap. |
| Gerakan atau perubahan pada sel hidup | Preparat basah yang kompatibel; kontras fase atau DIC | Tanpa pewarna | Memerlukan optik yang sesuai; kontras tidak mengidentifikasi suatu molekul. |
| DNA inti | Sel terfiksasi; fluoresensi | DAPI | Memerlukan filter eksitasi dan emisi yang kompatibel. |
| DNA inti pada sel hidup | Sel hidup; fluoresensi | Hoechst 33342 | Masuknya pewarna ke dalam sel tidak membuktikan bahwa kondisi pencitraan tidak berbahaya. |
| Integritas membran bakteri | Bakteri tidak terfiksasi; fluoresensi | SYTO 9 dengan propidium iodida | Pewarnaan membran merupakan ukuran tidak langsung dari viabilitas. |
Untuk apusan sederhana, ganti metodenya dengan cermat
Kristal violet merupakan kandidat praktis ketika tugasnya adalah memperoleh tampilan satu warna dari morfologi bakteri. Bacteriological Analytical Manual FDA mencantumkan dua formulasi kristal violet yang sesuai untuk pewarnaan sederhana. Gunakan formulasi yang terdokumentasi beserta metode preparasinya; nama pewarna saja tidak menentukan reagen kerja.
Kristal violet juga digunakan dalam pewarnaan Gram, tetapi itu tidak menjadikan pewarnaan sederhana kristal violet sebagai pewarnaan Gram. Dalam protokol pewarnaan Gram ASM, hasil diferensial bergantung pada kristal violet, iodin, dekolorisasi, dan pewarnaan tandingan yang bekerja secara berurutan. Menghilangkan langkah-langkah tersebut mengubah apa yang dapat ditetapkan dari gambar. Lihat pewarnaan sederhana versus pewarnaan Gram untuk memahami perbedaannya.
Nigrosin menawarkan cara berbeda untuk menampilkan garis luar: pewarna ini menggelapkan latar belakang sementara sel bakteri tetap relatif terang. Ada detail penting dalam petunjuk nigrosin Merck yang dapat terlewat dalam daftar pengganti umum. Formulasi kerja yang ditentukannya mengandung formaldehida. Karena itu, Anda tidak dapat menyimpulkan kompatibilitas dengan sel hidup hanya dari istilah “pewarnaan negatif,” meskipun sel itu sendiri tampak tidak terwarnai. Periksa formulasi lengkap dan preparasi spesimen.
Untuk spesimen hidup, pertimbangkan untuk mengubah optiknya
Jika Anda ingin mengamati sel bergerak atau membelah, menambahkan pewarna lain dapat mempersulit pengamatan. Seperti dijelaskan Nikon dalam panduannya tentang kontras pada spesimen transparan, kontras fase dan differential interference contrast, atau DIC, membuat spesimen terlihat melalui perbedaan sifat optiknya. Metode ini dapat menampilkan sel hidup tanpa pewarna, asalkan mikroskop memiliki komponen yang diperlukan.
Pilihan ini mempertahankan preparat tanpa pewarna, tetapi mengubah informasi yang tersedia. Anda dapat mengikuti batas atau gerakan tanpa mengetahui molekul mana yang menghasilkan kontras tersebut. Jika pertanyaannya adalah lokalisasi molekuler, pilih metode pelabelan yang sesuai.
Untuk DNA inti, perbandingan pewarna DAPI dan Hoechst dari Invitrogen membedakan penggunaan umum DAPI pada sel terfiksasi dari Hoechst 33342 yang lebih mudah menembus sel dan lebih disukai untuk pelabelan sel hidup. Keduanya memerlukan peralatan fluoresensi. Tidak satu pun merupakan pengganti langsung untuk pewarna berwarna pada brightfield.
Perlakukan paparan pewarna dan pencahayaan sebagai kondisi eksperimen. Bandingkan preparat yang diwarnai dan yang tidak diwarnai ketika perilaku sel merupakan parameter yang Anda ukur.
Sel merah tidak otomatis berarti sel mati
SYTO 9 dan propidium iodida sering digunakan berpasangan untuk menilai integritas membran bakteri. Panduan BacLight mengaitkan membran utuh dengan pewarnaan hijau dan membran yang rusak dengan pewarnaan merah. Interpretasi tersebut perlu divalidasi untuk spesimen yang digunakan.
Sebuah studi tahun 2019 oleh Rosenberg dan kolega menggambarkan masalah tersebut. Pada biofilm E. coli berusia 24 jam di atas kaca dalam phosphate-buffered saline, sekitar 96% sel tampak positif propidium iodida secara in situ. Namun, para penulis memperkirakan bahwa 82% dapat dikultur setelah dipanen. Gambar konfokal menunjukkan sel dengan bagian dalam berwarna hijau di bawah material berwarna merah, yang mengindikasikan bahwa asam nukleat ekstraseluler berkontribusi pada sinyal yang menyesatkan.
Persentase tersebut menggambarkan pengukuran yang berbeda pada preparat dalam studi itu, bukan faktor koreksi universal. Pelajaran yang berguna adalah memeriksa apa yang menghasilkan sinyal tersebut. Dalam biofilm, pewarna asam nukleat dapat mendeteksi material di luar sel maupun di dalam sel yang rusak. Untuk menyimpulkan viabilitas, para peneliti merekomendasikan pengukuran pelengkap, seperti kultivasi atau aktivitas metabolik, sambil mengakui bahwa masing-masing memiliki keterbatasan.
Periksa apa yang sebenarnya terkandung dalam alternatif tersebut
Metode pewarnaan alternatif tetap dapat mengandung metilena biru. Giemsa adalah salah satu contohnya: Merck mendeskripsikan produknya sebagai larutan azure-eosin-methylene-blue, yang ditujukan untuk aplikasi termasuk apusan darah dan sumsum tulang. Metode ini dapat menjadi metode berbeda untuk spesimen berbeda, tetapi tidak memenuhi persyaratan untuk mengecualikan metilena biru.
Jika mengecualikan suatu senyawa merupakan bagian dari eksperimen, periksa identitas dan formulasi reagen sebelum membandingkan gambar. Panduan tentang methyl blue, methylene blue, dan pewarna dengan nama serupa membahas perbedaan penamaan tersebut.
Verifikasi substitusi sebelum menggunakan hasilnya
Untuk metode baru, lakukan perbandingan skala kecil menggunakan spesimen yang representatif dan kontrol yang sesuai. Pertahankan pengaturan mikroskop agar sebanding jika memungkinkan. Catat formulasi reagen, preparasi spesimen, paparan, dan kondisi pencitraan agar gambar yang tampak lebih baik dapat diselidiki, bukan sekadar dianggap lebih baik.
Nilai keberhasilan berdasarkan pertanyaan awal. Untuk morfologi, periksa apakah batas dan susunan sel tetap dapat diinterpretasikan. Untuk pelabelan inti, nilai lokasi sinyal dan latar belakang. Untuk viabilitas, perlukan bukti selain pemisahan warna yang tampak menarik. Panduan yang lebih luas tentang pewarnaan metilena biru dan aplikasi laboratorium menjelaskan bagaimana pengamatan dan preparasi saling berkaitan.
Pilih alternatif yang mempertahankan pengukuran yang Anda perlukan. Warna hanyalah salah satu sifat dari gambar yang dihasilkan.