Փորձերը, որոնք մեթիլեն կապույտը կապեցին բջջային շնչառության հետ

Մարդու դեֆիբրինացված արյունը, երեք ժամ 37 °C-ում պահելիս, սպառում է իր պարունակած թթվածնի մոտ երկու տոկոսը։ Ինկուբացիայից առաջ փոքր քանակությամբ մեթիլեն կապույտ ավելացնելու դեպքում նույն արյունը սպառում է մոտ վաթսունհինգ տոկոսը։ Բջիջներում ոչինչ չէր փոխվել։ Փոխվել էր միայն լուծույթը։

Այս թիվը վերցված է Ջոնս Հոփքինսի համալսարանում Ջորջ Հարրոպի և Է․ Ս․ Գուզման Բարրոնի՝ 1928 թվականին հրապարակած հոդվածից։ Հենց այնտեղից է ծագում հաճախ կրկնվող այն պնդումը, որ մեթիլեն կապույտը բարելավում է բջջային շնչառությունը։ Պնդումը սխալ չէ, սակայն դրա իմաստն ավելի նեղ է, քան կարող է թվալ։

Ինչ է իրականում չափում աղյուսակի թիվը

Չափվող վերջնական ցուցանիշը թթվածնի կլանումն էր՝ որոշված գազային վերլուծությամբ։ Հարրոպն ու Բարրոնը նոր վերցված արյունը 10 °C-ում բամբակի միջով զտում էին՝ սպիտակ արյան բջիջները հեռացնելու համար, նմուշը հագեցնում թթվածնով, բաժանում երկու մասի, մեկին ավելացնում ներկանյութ և ինկուբացիայից հետո վերլուծում երկուսն էլ։ Լեյկոցիտների քանակը հազվադեպ էր գերազանցում մոտ հազարն ամեն խորանարդ միլիմետրում։ Թթվածնի սպառումը ներկայացվում էր որպես նմուշում սկզբնապես եղած թթվածնի անհետացած բաժին։

Նրանք չափում էին նաև ածխաթթու գազը, բայց այստեղ մեթոդը դժվարություններ էր ստեղծում։ Ինկուբացիայի առաջին ժամում դեֆիբրինացված արյունն արտազատում էր մինչև երկու միլիմոլ ածխաթթու գազ՝ յուրաքանչյուր 100 mL-ի հաշվով, ուսումնասիրվող ռեակցիայի հետ չկապված պատճառներով։ Ուստի ամբողջական արյան շնչառական գործակիցները կիրառելի չէին։ Միայն Լոկի լուծույթում լվացված բջիջներն էին տալիս մեկնաբանելի ցուցանիշներ, որոնք թե՛ ներկանյութով, թե՛ առանց դրա գտնվում էին 0.73-ից 0.80 միջակայքում։

Այս մանրամասնությունը երկրորդական չէ։ Այդ հոդվածներում «շնչառություն» նշանակում է գազափոխանակություն փակ անոթում։ Թթվածնի սպառման և օգտակար էներգիայի արտադրության տարբերությունն առանձին քննարկվում է ինչ է թթվածնի սպառումը ցույց տալիս ATP-ի մասին, և ինչ չի ցույց տալիս հոդվածում։

Ներկանյութն ամենաշատն ավելացրեց այնտեղ, որտեղ բջիջներն ամենաքիչն էին շնչում

Կաթնասունների հասուն էրիթրոցիտներում թթվածնի չափելի սպառում գրեթե չկա։ Թռչունների կորիզավոր էրիթրոցիտներում այն կա։ Հարրոպն ու Բարրոնը փորձարկեցին երկուսն էլ, և հենց այդ հակադրությունն է նրանց փաստարկի հիմքը։

Կաթնասունների նմուշներում ներկանյութը առաջացրեց քսանապատիկից հիսնապատիկ աճ։ Սագի արյան դեպքում, որի բջիջներն արդեն շնչում էին, այն երբեք արագությունը կրկնապատիկից ավելի չմեծացրեց։ Որքան բարձր էր սկզբնական շնչառությունը, այնքան քիչ բան կարող էր ավելացնել ներկանյութը։

Նույն օրինաչափությունը նկատվում է նաև մեկ տեսակի ներսում։ Իսկական պոլիցիտեմիա ունեցող հիվանդի՝ չհասունացած բջիջներ պարունակող արյան նմուշն առանց ներկանյութի սպառում էր իր թթվածնի 11.3 տոկոսը, մինչդեռ առողջ դոնորի լվացված բջիջները՝ 2.8 տոկոսը։ Ներկանյութն առաջին ցուցանիշը հասցրեց ընդամենը 63.4 տոկոսի՝ առաջացնելով վեցապատիկ արագացում, մինչդեռ նորմալ բջիջներում արագացումը գրեթե երեսնապատիկ էր։ Ներկանյութը հասուն բջիջների վարքագիծը մոտեցնում էր չհասունացած բջիջների վարքագծին․ հենց այդպես էլ հեղինակները նկարագրում էին դրա ազդեցությունը։

Ցիանիդը պետք է կանգնեցներ դա

Հայտնի էր, որ ցիանիդը դադարեցնում է բջջային օքսիդացումը։ Հարրոպն ու Բարրոնը, այնուամենայնիվ, այն ավելացրին ներկանյութի հետ միասին։

Տավարի արյան արդյունքները բնորոշ օրինակ են։ Առանց հավելումների՝ երեք ժամում թթվածնի պարունակությունը 22.61 ծավալային տոկոսից նվազեց մինչև 22.03։ Մեթիլեն կապույտի առկայությամբ այն նվազեց մինչև 12.84։ Մեթիլեն կապույտի և մեկ հինգհազարերորդ մոլյար կոնցենտրացիայով կալիումի ցիանիդի առկայությամբ՝ մինչև 12.74։ Ներկանյութի ազդեցությունն ըստ էության մնաց անփոփոխ։

Նկար: մարդու էրիթրոցիտների միկրոշնչառության շարունակական գրանցում։ Սլաքը ցույց է տալիս մեթիլեն կապույտի ավելացման պահը։ Մինչ այդ կորը գրեթե հարթ է, իսկ դրանից հետո անընդհատ բարձրանում է։ Վերարտադրված է Հարրոպի և Բարրոնի հոդվածից, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478։

Նրանց եզրակացությունն այն էր, որ ներկանյութը գործում է որպես թթվածնի փոխադրիչ՝ «ապահովելով մի նյութ, որն անհետացել է հասուն կաթնասունների անկորիզ էրիթրոցիտներից»։ Երկու տարի անց Ռոքֆելլերի ինստիտուտի Միխայելիսն ու Սալոմոնը տարաձայնությունը ձևակերպեցին այնպես, ինչպես այն պահպանվել է հետագայում։ Կա՛մ ներկանյութի ազդեցությունը «ներկանյութի պատահական հատկություն է», կա՛մ ներկանյութը «օրգանիզմներում առկա ինչ-որ անհայտ նյութի մոդել է»։ Այս երկու տարբերակների միջև ընտրությունը դեռ վերջնականապես չի արվել։ Փոխվել է այն, որ այժմ բջիջները կարելի է շատ ավելի ճշգրիտ նկարագրել։

Լյարդի մզվածքը նույն ազդեցությունն ունեցավ

Միխայելիսն ու Սալոմոնը ցույց տվեցին, որ օրգանների սառը ջրային մզվածքները նույն խթանումն են առաջացնում։ Առնետի լյարդի ազդեցությունն ամենաուժեղն էր, որին հաջորդում էին երիկամը, փայծաղը և ամորձին։ Ուղեղը, մկանը և արյան շիճուկը քիչ ազդեցություն ունեին կամ ընդհանրապես չունեին։

Այնուհետև նրանք մզվածքը փորձարկեցին ածխածնի մոնօքսիդի առկայությամբ։ Թե՛ մզվածքով, թե՛ ներկանյութով առաջացած շնչառությունը չէր փոխվում 98 տոկոս ածխածնի մոնօքսիդ և 2 տոկոս թթվածին պարունակող խառնուրդում։ Նույն գազային խառնուրդը խմորասնկերի և հավերի կորիզավոր էրիթրոցիտների շնչառությունը ճնշում էր մոտ 60-ից 80 տոկոսով՝ համապատասխանելով ածխածնի մոնօքսիդի նկատմամբ զգայուն շնչառական ֆերմենտի մասին Վարբուրգի նկարագրությանը։ Հետևաբար հյուսվածքների չնույնականացված նյութը Վարբուրգի ֆերմենտը չէր։

Ընթացքում մի քանի հնարավոր տարբերակներ բացառվեցին։ Վերականգնված գլուտաթիոնն ու ցիստեինը առաջացնում էին միայն իրենց իսկ օքսիդացման համար անհրաժեշտ թթվածնի սպառումը։ Հարդենի և Յանգի կոֆերմենտը բացառվեց, քանի որ մկաններում դրա քանակն ամենամեծն է, մինչդեռ ազդեցությունը գրեթե ամենափոքրն էր։ Մի քանի տարի առաջ անվանված Կեյլինի ցիտոքրոմը բախվեց նույն հակասությանը։ Իրենց իսկ վարկածը, որ ակտիվ նյութը ծագում է բջջի կորիզից, նրանք անվանեցին ընդամենը ենթադրություն։

Ազդեցությունն ուներ անհրաժեշտ պայմաններ

Բջիջները պետք է ամբողջական լինեին։ Թորած ջրով կամ կրկնվող սառեցմամբ առաջացած հեմոլիզը վերացնում էր թե՛ ներկանյութի, թե՛ մզվածքի նկատմամբ արձագանքը, իսկ մասնակի հեմոլիզը համամասնորեն նվազեցնում էր այն։

Անհրաժեշտ էր նաև շաքար։ Գլյուկոզան, ֆրուկտոզան և սախարոզան ապահովում էին ներկանյութով առաջացած շնչառությունը, իսկ մանիտոլը՝ ոչ։ Առանց շաքարի շնչառություն ընդհանրապես չկար, և թվում էր, թե այդ ընթացքում ներկանյութը վնասում է բջիջները, ուստի մեկ կամ երկու ժամ անց ավելացված գլյուկոզան այն չէր վերականգնում։ Հեղինակները ենթադրում էին, որ ներկանյութն օքսիդացնում է բջջին անհրաժեշտ կառուցվածքային բաղադրիչը։

Լուսավորությունը զգալիորեն ուժեղացնում էր ներկանյութի ազդեցությունը, թեև այն հստակ արտահայտված էր նաև մթության մեջ։ Վերականգնվելու ունակ այլ ներկանյութեր այլ կերպ էին գործում․ տոլուիլեն կապույտը հավասարվում էր մեթիլեն կապույտին կամ գերազանցում այն, մինչդեռ ինդիգո դիսուլֆոնատը գրեթե ոչինչ չէր փոխում։ Ներկանյութի օքսիդավերականգնման պոտենցիալի և դրա ազդեցության մեծության միջև հստակ կապ չհայտնաբերվեց, ինչը հեղինակները բացատրում էին թաղանթի թափանցելիությամբ և թունավորությամբ։

Ազդեցությունը կապված էր խմորման, ոչ թե շնչառության հետ

Բարրոնի 1930 թվականի ուսումնասիրությունը բջջային կախույթներից անցավ առնետների նորմալ օրգանների և փոխպատվաստված ուռուցքների հյուսվածքային կտրվածքներին։

Աերոբ գլիկոլիզ չունեցող հյուսվածքներում մեթիլեն կապույտը ոչինչ չէր փոխում կամ փոքր-ինչ ճնշում էր թթվածնի սպառումը․ երիկամում՝ մոտ 14 տոկոսով, ենթաստամոքսային գեղձում՝ մոտ 14 տոկոսով, լյարդում՝ մոտ 5 տոկոսով։ Թթվածնի առկայությամբ խմորում իրականացնող հյուսվածքներում այն մեծացնում էր սպառումը․ փայծաղում՝ մոտ 8 տոկոսով, ուղեղում՝ մոտ 13 տոկոսով։ Ուռուցքներում աճը տատանվում էր մարդու կրծքագեղձի կարցինոմայի մոտ 27 տոկոսից մինչև Ռոուսի հավի սարկոմայի ավելի քան 80 տոկոսը՝ մոտավորապես համամասնորեն յուրաքանչյուր հյուսվածքի աերոբ գլիկոլիզին։

Նկար: յուրաքանչյուր կետը ներկայացնում է հյուսվածքի մեկ տեսակ։ Հորիզոնական առանցքը աերոբ գլիկոլիզն է, իսկ ուղղահայացը՝ մեթիլեն կապույտի ավելացումից հետո թթվածնի սպառման փոփոխությունը։ Տվյալները՝ Բարրոն, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), աղյուսակ 6, PMID 19869777։

Այնուհետև ցիանիդով փորձը տվեց հակառակ պատկերը։ Երբ նախկինում չարձագանքող այդ հյուսվածքներում շնչառությունն արգելակվեց ցիանիդով, և խմորումը դրսևորվեց, ներկանյութը կրկին մեծացրեց թթվածնի սպառումը․ երիկամում՝ մոտ 59 տոկոսով, լյարդում՝ մոտ 19 տոկոսով, փայծաղում՝ մոտ 286 տոկոսով, ամորձում՝ մոտ 200 տոկոսով։

Բարրոնն առաջարկեց, որ ներկանյութը կարող է ծառայել որպես բջջի կամ հյուսվածքի խմորման կարողությունը ստուգելու միջոց, և ավարտեց մի ենթադրությամբ․ ներկանյութ պարունակող միջավայրում ուռուցքի կուլտուրայի հաջորդական սերունդները մի օր գուցե ուռուցքի նյութափոխանակությունը մշտապես դարձնեն նորմալ հյուսվածքի նյութափոխանակությանը նման։ Դա 1930 թվականին ձևակերպված հետազոտական հարց էր։ Այն բուժման մասին պնդում չէ։

Ինչ չէին կարող չափել այդ փորձերը

1928 և 1930 թվականներին «շնչառություն» նշանակում էր թթվածնի սպառում։ Ադենոզին եռաֆոսֆատն առաջին անգամ նկարագրվեց 1929 թվականին, իսկ այն, որ առանձնացված միտոքոնդրիաները էլեկտրոններ փոխանցելիս էսթերիֆիկացնում են ֆոսֆատը, ցուցադրվեց 1949 թվականին։ Մեթիլեն կապույտի մասին վաղ հոդվածներից ոչ մեկը չէր կարող չափած լինել էներգիայի արտադրությունը, և դրանցից ոչ մեկն էլ նման պնդում չէր անում։

Երկրորդ խնդիրը բջիջներն են։ Կաթնասունների հասուն էրիթրոցիտները միտոքոնդրիաներ չունեն։ Ռետիկուլոցիտի փուլում դրանք ընտրողական աուտոֆագիայի միջոցով հեռացնում են միտոքոնդրիաներն ու ռիբոսոմները։ Այդ պատճառով հասուն կարմիր արյան բջիջը գործում է գլիկոլիզի հաշվին և իր պենտոզաֆոսֆատային ուղուց կախված է հիմնականում NADPH-ի, այլ ոչ թե ATP-ի համար։ 1928 թվականի փորձերում վերականգնման ենթակա էլեկտրոնների փոխադրման շղթա գոյություն չուներ։ Ինչ էլ սպառում էր թթվածինը, այն մեկ այլ գործընթաց էր իրականացնում։

Թե ինչ էր այդ այլ գործընթացը, այժմ բավական լավ է նկարագրված։ Մեթիլեն կապույտն էլեկտրոններ է ընդունում բջջային վերականգնող համարժեքներից և դառնում լեյկոմեթիլեն կապույտ, որն այնուհետև կրկին օքսիդացվում է մոլեկուլային թթվածնով՝ փակելով ցիկլը։ Մարդու կարմիր արյան բջիջներում վերականգնման փուլն իրականացնում են NADPH-ից կախված ֆլավին ռեդուկտազը և հարակից դիսուլֆիդ ռեդուկտազները։ Նշակիր գլյուկոզայով կատարված 1976 թվականի ուսումնասիրությունը պարզեց, որ ներկանյութը խթանում է հեքսոզամոնոֆոսֆատային շունտը, որ ցածր կոնցենտրացիայի ազդեցությունը կախված էր օքսիհեմոգլոբինից, և որ ավելի բարձր՝ 0.1 mM կոնցենտրացիան առաջացնում էր ջրածնի պերօքսիդ։ Թթվածնին հանդիպող վերականգնված ներկանյութն առաջացնում է պերօքսիդ, ոչ թե ֆոսֆատային կապեր։

Միտոքոնդրիաներում պատկերն ավելի վիճելի է, քան ընդունում են հանրամատչելի ամփոփումները։ Հետազոտությունների մի ուղղության համաձայն՝ ներկանյութը էլեկտրոններ է վերցնում I համալիրի հատվածից և փոխանցում ցիտոքրոմ c-ին։ Մեկ այլ ուսումնասիրություն պարզել է, որ մկան ուղեղի միտոքոնդրիաներում այն չի կարող վերականգնել շնչառությունն անտիմիցինով արգելակումից հետո, և փոխարենը էլեկտրոնների ընդունման տեղը վերագրել է III համալիրի ուբիքինոլը կապող տեղամասին։ Երրորդը պարզել է, որ ցածր կոնցենտրացիաները մեծացնում են հանգստի վիճակում թթվածնի սպառումը՝ անփոփոխ թողնելով ADP-ով խթանված շնչառությունը։ Այս միտքն ամենաուղղակիորեն արտահայտվում է նրանով, որ մեթիլեն կապույտով առաջացած թթվածնի սպառումն ընդհանրապես կախված չէ օքսիդատիվ ֆոսֆորիլացումից․ այն պահպանվում էր թե՛ շնչառական շղթայի արգելակման դեպքում, թե՛ այդ շղթան չունեցող պատրաստուկներում։

Կան նաև այդ երկու մեծությունների տարբերության ուղղակի չափումներ։ Առնետի լյարդի առանձնացված միտոքոնդրիաներում ներկանյութի կոնցենտրացիայի մեծացումը նվազեցնում էր շնչառական հսկողության գործակիցները և առաջացնում ուռչում, ինչը հեղինակները նկարագրել են որպես օքսիդատիվ ֆոսֆորիլացման տարանջատում։ Առնետի պերֆուզիայի ենթարկված լյարդում մեթիլեն կապույտը մեծացնում էր թթվածնի սպառումը, մինչդեռ ATP-ի և ADP-ի հարաբերակցությունը նվազում էր։

Կլինիկական տվյալներն էլ նույնն են ցույց տալիս։ Մեթհեմոգլոբինեմիան բուժվում է ներերակային ճանապարհով՝ յուրաքանչյուր կիլոգրամի հաշվով մոտ մեկից երկու միլիգրամ մեթիլեն կապույտով՝ NADPH-ից կախված վերականգնման ուղու միջոցով, իսկ ավելի մեծ դեղաչափերն առաջացնում են հենց այն վիճակը, որը բուժվում է։ Նույն ակնարկը նշում է, որ հակաթունային ազդեցությունն ամենամեծն է ամբողջական էրիթրոցիտներում և նվազում է հեմոլիզի առկայությամբ․ սա 1930 թվականի հեմոլիզի վերաբերյալ դիտարկումն է, որը յոթանասուներեք տարի անց կրկին ի հայտ է գալիս հիվանդանոցային պայմաններում։ Միացությունը, որի օգտակար և վնասակար ազդեցությունները գտնվում են դեղաչափի շեմի հակառակ կողմերում, այն միացությունը չէ, որի դեղաչափը պետք է որոշել թթվածնի սպառման չափումից։

Ինչու խմբաքանակը պետք է քննարկման մաս լինի

Հարրոպն ու Բարրոնը նկատեցին մի բան, որն արժե կրկին կարդալ։ Մեթիլեն կապույտն ինքնին սպեկտրոսկոպում առաջացնում է շերտ՝ մեթհեմոգլոբինին բնորոշ երկու շերտերի միջև, «ինչը մակերեսային զննման ժամանակ հեշտությամբ կարող է շփոթության հանգեցնել»։ Ներկանյութը կարող է նմանակել որոնվող նյութը։

Նույն խնդիրը կա նաև քիմիական մակարդակում։ Որպես փոքրաքանակ բաղադրիչ առկա հարակից ֆենոթիազինն ունի իր սեփական օքսիդավերականգնման վարքագիծը, թափանցելիությունն ու թունավորությունը։ Փաստագրված մի դեպք խնդրի նշանակությունը դարձնում է շոշափելի․ մեթիլեն կապույտի յոդացման ուսումնասիրության ընթացքում մոտ 7-ից 8 տոկոս Azure B պարունակող նմուշները հիմնականում առաջացնում էին յոդացված Azure B, այսինքն՝ ռեակցիայում գերակշռում էր խառնուրդը, այլ ոչ թե մեթիլեն կապույտը։

Յուրաքանչյուր ոք, ով մեթիլեն կապույտն օգտագործում է որպես ռեագենտ՝ լաբորատորիայում, ներկման աշխատանքային սեղանի մոտ կամ ակվարիումում, գործ ունի չճշտված բաղադրության նյութի հետ, եթե խմբաքանակի բնութագրերը որոշված չեն։ Հարակից նյութերը, նույնականացումը, տարրային խառնուրդները, մնացորդային լուծիչները և շիկացումից հետո մնացորդը փորձի մասն են, ոչ թե այն ուղեկցող փաստաթղթային ձևականություններ։ Blupreme-ն իր մեթիլեն կապույտը ձեռք է բերում դեղագործական արտադրողից և հրապարակում վերլուծության ամբողջական հավաստագիր՝ ստուգելով USP-ի ամբողջ տեխնիկական պահանջները, ոչ միայն ծանր մետաղները։ Վերլուծության հավաստագիրը կարդալու ուղեցույցը և ինչ է հաստատում USP կարգի նշումը, և ինչ չի հաստատում հոդվածը բացատրում են, թե ինչպես համեմատել փաստաթուղթը ներկայացվող պնդման հետ։

Թիվը ճիշտ էր

1928 և 1930 թվականների փորձերը մանրակրկիտ էին, և դրանց հիմնական դիտարկումը պահպանվել է․ վերականգնվելու ունակ ներկանյութը կարող է գրեթե չշնչող բջջին ստիպել թթվածին սպառել հանգստի վիճակի արագությունից բազմապատիկ արագությամբ՝ շրջանցելով այն փուլը, որն արգելակում է ցիանիդը։

Սխալն ի հայտ է գալիս ավելի ուշ, երբ «շնչառություն» բառը մեկնաբանվում է իր ժամանակակից իմաստով։ Գազափոխանակության չափումը ցույց է տալիս, որ էլեկտրոնները հասել են թթվածնին։ Այն չի ցույց տալիս, որ դրանցից որևէ մեկն օգտագործվել է ATP արտադրելու համար, իսկ միտոքոնդրիաներ չունեցող բջջում այդ երկու պնդումների միջև տարբերությունն առավելագույնն է։ Բջիջներում մեթիլեն կապույտի գործողությունների ավելի լայն պատկերը նույն տարբերությունը ներկայացնում է ավելի լայն համատեքստում, իսկ միացության պատմությունը՝ ներկանյութից մինչև դեղամիջոց բացատրում է, թե ինչպես տեքստիլ ներկանյութն ի սկզբանե հասավ այս փորձերին։