Eksperyans ki te lye ble metilèn ak respirasyon selilè

San imen yo retire fibrin ladan l, yo kenbe a 37 °C pandan twa èdtan, konsome anviwon de pousan nan oksijèn li genyen an. Ajoute yon ti kantite ble metilèn anvan enkibasyon an, epi menm san an konsome anviwon swasant-senk pousan. Anyen pa t chanje nan selil yo. Se sèlman solisyon an ki te chanje.

Chif sa a soti nan yon atik George Harrop ak E. S. Guzman Barron nan Johns Hopkins te pibliye an 1928, epi se li ki nan orijin deklarasyon moun repete anpil la ki di ble metilèn amelyore respirasyon selilè. Deklarasyon an pa fo, men li gen yon sans pi limite pase sa li sanble di.

Sa chif ki nan tablo a mezire toutbon

Sa yo te mezire a se te kantite oksijèn selil yo te pran, yo te detèmine avèk analiz gaz. Harrop ak Barron te filtre san yo te fèk pran nan koton a 10 °C pou retire globil blan yo, yo te satire echantiyon an ak oksijèn, yo te divize l, yo te ajoute koloran nan yon pòsyon, epi yo te analize toude apre enkibasyon. Kantite lekosit yo te raman depase anviwon mil pou chak milimèt kib. Yo te rapòte konsomasyon oksijèn kòm pwopòsyon nan oksijèn echantiyon an te genyen okòmansman ki te disparèt.

Yo te mezire diyoksid kabòn tou, epi se la metòd la te bay pwoblèm. San yo te retire fibrin ladan l te lage jiska de milimòl diyoksid kabòn pou chak 100 mL nan premye èdtan enkibasyon an, pou rezon ki pa t gen rapò ak reyaksyon yo t ap etidye a; kidonk, kosyan respiratwa ki te soti nan san antye a pa t ka sèvi. Se sèlman selil lave nan solisyon Locke ki te bay chif yo te ka entèprete, epi chif sa yo te gwoupe ant 0.73 ak 0.80, avèk oswa san koloran an.

Detay sa a pa san enpòtans. Nan atik sa yo, “respirasyon” vle di echanj gaz nan yon resipyan fèmen. Yo egzamine diferans ant konsomasyon oksijèn ak pwodiksyon enèji itil apa nan sa konsomasyon oksijèn di w ak sa li pa di w sou ATP.

Koloran an te ajoute plis kote selil yo te respire mwens

Eritwosit mamifè ki fin matirite yo prèske pa gen okenn konsomasyon oksijèn moun ka mezire. Eritwosit zwazo ki gen nwayo yo genyen. Harrop ak Barron te teste toude, epi kontras la se baz agiman yo a.

Nan echantiyon mamifè yo, koloran an te fè konsomasyon an ogmante ven a senkant fwa. Nan san zwa, kote selil yo te deja respire, li pa t janm fè vitès la plis pase double. Plis respirasyon an te wo okòmansman, se mwens koloran an te ka ajoute.

Menm tandans sa a parèt anndan yon sèl espès. Yon echantiyon san imen ki te soti nan yon pasyan ki te gen polisitemi vera, epi ki te genyen selil ki poko matirite, te konsome 11.3 pousan nan oksijèn li san koloran, konpare ak 2.8 pousan pou selil lave ki te soti nan yon donatè an sante. Koloran an te sèlman fè l rive nan 63.4 pousan, yon akselerasyon sis fwa, tandiske selil nòmal yo te akselere prèske trant fwa. Koloran an te pouse selil ki fin matirite yo konpòte yo plis tankou selil ki poko matirite, e se sa otè yo te di li t ap fè.

Syanid ta dwe te bloke sa

Yo te konnen syanid bloke oksidasyon selilè. Harrop ak Barron te ajoute l kanmenm, ansanm ak koloran an.

Rezilta sou san bèf yo bay yon egzanp tipik. Kantite oksijèn nan te bese soti nan 22.61 pou rive nan 22.03 volim pou chak san pandan twa èdtan, san yo pa ajoute anyen. Avèk ble metilèn, li te bese pou rive nan 12.84. Avèk ble metilèn ak syanid potasyòm nan yon konsantrasyon molè yon senk milyèm, li te bese pou rive nan 12.74. Efè koloran an te prèske pa chanje ditou.

Figi: yon anrejistreman kontinyèl mikworespirasyon eritwosit imen. Flèch la make moman yo ajoute ble metilèn nan. Anvan sa, koub la prèske plat; apre sa, li monte san rete. Repwodui dapre Harrop ak Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Konklizyon yo se te ke koloran an te aji kòm yon transpòtè oksijèn, “li bay yon sibstans ki te disparèt nan eritwosit mamifè adilt ki pa gen nwayo yo.” Dezan apre, Michaelis ak Salomon nan Rockefeller Institute te bay dezakò a fòm li toujou genyen an. Swa efè koloran an se te “yon pwopriyete aksidantèl koloran an,” swa koloran an se te “yon modèl pou yon sibstans enkoni nan òganis yo.” Yo poko deside ant de posiblite sa yo. Sa ki chanje, se ke kounye a yo ka dekri selil yo avèk anpil plis presizyon.

Yon ekstrè fwa te fè menm bagay la

Michaelis ak Salomon te montre ekstrè ògàn yo prepare ak dlo frèt pwodui menm estimilasyon an. Fwa rat te bay efè ki pi fò a, apre sa ren, larat ak tèstikil. Sèvo, misk ak sewòm san te gen ti efè oswa pa t gen efè ditou.

Apre sa, yo te teste ekstrè a an prezans monoksid kabòn. Respirasyon ekstrè a oswa koloran an te pwovoke a pa t chanje nan yon melanj 98 pousan monoksid kabòn ak 2 pousan oksijèn. Menm melanj gaz la te anpeche respirasyon ledven ak respirasyon eritwosit zwazo ki gen nwayo yo pa anviwon 60 a 80 pousan, ann akò ak deskripsyon Warburg sou yon fèman respiratwa ki sansib a monoksid kabòn. Kidonk, sibstans yo pa t idantifye nan tisi a pa t anzim Warburg la.

Yo te elimine plizyè sibstans ki te kandida pou idantite sa a pandan rechèch la. Glitatyon redui ak sisteyin te pwodui sèlman konsomasyon oksijèn pwòp oksidasyon yo te mande a. Yo te elimine koanzim Harden ak Young lan paske se misk ki genyen plis ladan l, tandiske li te montre prèske pi piti efè a. Sitokwòm Keilin nan, yo te bay non kèk ane anvan, te tonbe sou menm kontradiksyon an. Pwòp lide pa yo a, ki te di sibstans aktif la te soti nan nwayo selil la, yo te rele l yon senp sijesyon.

Efè a te depann de kèk kondisyon

Selil yo te dwe rete entak. Emoliz ak dlo distile oswa konjelasyon repete te elimine repons ni a koloran an ni a ekstrè a, epi emoliz pasyèl te redui l an pwopòsyon.

Sik te nesesè tou. Glikoz, friktoz ak sakawoz te soutni respirasyon koloran an te pwovoke a; manitòl pa t fè sa. San sik, pa t gen respirasyon ditou, epi koloran an te sanble domaje selil yo pandan pwosesis la, kidonk glikoz yo te ajoute youn oswa de èdtan apre pa t retabli respirasyon an. Otè yo te sijere koloran an t ap okside yon eleman estriktirèl selil la te bezwen.

Limyè te ogmante efè koloran an anpil, menm si efè a te klè nan fènwa. Lòt koloran ki ka sibi rediksyon te konpòte yo yon fason diferan: ble tolilèn te egal oswa depase ble metilèn, tandiske disilfonat endigo te prèske pa fè anyen. Pa t gen okenn relasyon klè ant potansyèl oksidasyon-rediksyon yon koloran ak grandè efè li, yon bagay otè yo te atribye a pèmeyabilite manbràn ak toksisite.

Efè a te suiv fèmantasyon, pa respirasyon

Etid Barron an 1930 te pase soti nan sispansyon selil pou rive nan tranch tisi ògàn nòmal rat ak timè yo te transplante.

Nan tisi ki pa t gen glikoliz ayewobik, ble metilèn pa t fè anyen oswa li te redui konsomasyon oksijèn yon ti jan: ren pa anviwon 14 pousan, pankreyas pa anviwon 14 pousan, fwa pa anviwon 5 pousan. Nan tisi ki fè fèmantasyon an prezans oksijèn, li te ogmante konsomasyon an: larat pa anviwon 8 pousan, sèvo pa anviwon 13 pousan. Ogmantasyon nan timè yo te soti nan anviwon 27 pousan nan yon kasinòm tete imen pou rive nan plis pase 80 pousan nan yon sakòm Rous poul, apeprè an pwopòsyon ak glikoliz ayewobik chak tisi.

Figi: chak pwen reprezante yon kalite tisi. Aks orizontal la se glikoliz ayewobik; aks vètikal la se chanjman nan konsomasyon oksijèn apre ble metilèn. Done ki soti nan Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Tablo 6, PMID 19869777.

Eksperyans ak syanid la te bay rezilta envès la apre sa. Lè yo te bloke respirasyon avèk syanid nan tisi sa yo ki pa t reponn anvan, epi fèmantasyon te vin parèt, koloran an te ogmante konsomasyon oksijèn ankò: ren pa anviwon 59 pousan, fwa pa anviwon 19 pousan, larat pa anviwon 286 pousan, tèstikil pa anviwon 200 pousan.

Barron te pwopoze koloran an te ka sèvi kòm yon tès pou kapasite fèmantasyon yon selil oswa yon tisi, epi li te fini ak yon sipozisyon: plizyè jenerasyon kilti timè nan yon milye ki gen koloran ta ka yon jou fè metabolis yon timè vin sanble ak metabolis tisi nòmal yon fason pèmanan. Se te yon kesyon rechèch yo te ekri an 1930. Se pa yon reklamasyon sou tretman.

Sa eksperyans yo pa t ka mezire

An 1928 ak 1930, “respirasyon” te vle di konsomasyon oksijèn. Yo te rapòte adenozin trifosfat pou premye fwa an 1929, epi se an 1949 yo te demontre mitokondri izole esterifye fosfat pandan yo transfere elektwon. Okenn nan premye atik sou ble metilèn yo pa t ka mezire pwodiksyon enèji, epi okenn ladan yo pa t pretann yo te fè sa.

Selil yo se dezyèm pwoblèm nan. Eritwosit mamifè ki fin matirite yo pa gen mitokondri. Pandan etap retikilosit la, yo elimine mitokondri ak ribozòm atravè otofaji selektif; se poutèt sa yon globil wouj ki fin matirite fonksyone gras a glikoliz epi li depann de chemen fosfat pentoz li sitou pou NADPH olye pou ATP. Nan eksperyans 1928 yo, pa t gen okenn chèn transpò elektwon pou repare. Kèlkeswa sa ki t ap konsome oksijèn nan, li t ap fè yon lòt bagay.

Kounye a, yo dekri lòt bagay sa a ak yon presizyon ki rezonab. Ble metilèn aksepte elektwon ki soti nan ekivalan rediktè selilè epi li vin ble lèkometilèn; oksijèn molekilè okside l ankò, sa ki fè sik la boukle. Nan globil wouj imen, flavin rediktaz ki depann de NADPH ak lòt rediktaz disilfid ki gen rapò avè l fè etap rediksyon an. Yon etid an 1976 ki te itilize glikoz make te jwenn koloran an estimile chemen devyasyon eksoz monofosfat la, efè a nan konsantrasyon ba te depann de oksiemoglobin, epi yon konsantrasyon pi wo, 0.1 mM, te pwodui pewoksid idwojèn. Yon koloran redui ki rankontre oksijèn pwodui pewoksid, pa lyezon fosfat.

Nan mitokondri, gen plis dezakò sou sitiyasyon an pase rezime popilè yo admèt. Yon seri rechèch soutni koloran an pran elektwon nan zòn konplèks I epi li pase yo bay sitokwòm c. Yon lòt te jwenn nan mitokondri sèvo sourit, li pa ka retabli respirasyon apre yon blokaj ak antimisinn, epi li te pito plase akseptè elektwon an nan sit lyezon ibikinòl konplèks III a. Yon twazyèm te jwenn konsantrasyon ba te ogmante konsomasyon oksijèn nan repo, pandan respirasyon ADP estimile a pa t chanje. Fason ki pi dirèk pou di pwen sa a se ke konsomasyon oksijèn ble metilèn pwovoke a pa depann ditou de fosforilasyon oksidatif: li te pèsiste lè yo te anpeche chèn respiratwa a fonksyone, epi nan preparasyon ki pa t gen chèn sa a.

Gen mezi dirèk diferans ant de kantite sa yo tou. Nan mitokondri izole ki soti nan fwa rat, ogmantasyon konsantrasyon koloran an te bese rapò kontwòl respiratwa yo epi li te lakòz anflamasyon, sa otè yo te dekri kòm dekouplaj fosforilasyon oksidatif. Nan fwa rat yo te fè likid sikile ladan l, ble metilèn te ogmante konsomasyon oksijèn pandan rapò ATP sou ADP a te bese.

Done klinik yo pote menm mesaj la. Yo trete metemoglobinemi avèk anviwon youn a de miligram ble metilèn pou chak kilogram nan venn, atravè yon chemen rediksyon ki depann de NADPH, epi dòz ki pi gwo lakòz kondisyon yo t ap trete a. Menm revizyon an remake efè kòm antidòt la pi fò nan eritwosit entak epi li diminye lè gen emoliz, sa ki se rezilta emoliz 1930 lan ki reparèt swasanntwazan apre nan yon kontèks lopital. Yon konpoze ki gen efè itil ak efè danjere sou de bò opoze yon papòt dòz se pa yon konpoze yo ta dwe dedui dòz li apati yon mezi konsomasyon oksijèn.

Poukisa lo a gen plas li nan diskisyon an

Harrop ak Barron te remake yon bagay ki merite pou yo li l yon dezyèm fwa. Ble metilèn li menm pwodui yon bann nan espektwoskòp la ant de bann karakteristik metemoglobin yo, “sa ki ka fasil lakòz konfizyon lè yo fè yon egzamen rapid.” Koloran an ka imite sibstans y ap chèche a.

Menm pwoblèm nan gen yon fòm chimik. Yon fenotyazin ki gen rapò avè l, ki prezan kòm yon konstitiyan minè, gen pwòp konpòtman oksidasyon-rediksyon pa li, pwòp pèmeyabilite pa li ak pwòp toksisite pa li. Yon ka ki dokimante montre sa ki an jwèt yon fason konkrè: nan yon etid sou yodasyon ble metilèn, echantiyon ki te genyen anviwon 7 a 8 pousan Azure B te pwodui sitou Azure B yode, kidonk se enpite a olye ble metilèn nan ki te domine reyaksyon an.

Nenpòt moun ki sèvi ak ble metilèn kòm reyaktif, nan yon laboratwa, nan yon estasyon kolorasyon oswa nan yon akwaryòm, ap travay ak yon engredyan ki pa byen defini sof si yo te karakterize lo a. Sibstans ki gen rapò yo, idantite, enpite elemantè, sòlvan rezidyèl ak rezidi apre kalsinasyon fè pati eksperyans lan, yo pa senp papye ki antoure l. Blupreme jwenn ble metilèn li nan men yon manifakti famasetik epi li pibliye yon sètifika analiz konplè, ki teste tout spesifikasyon USP a olye sèlman metal lou; gid pou li yon sètifika analiz ak sa deziyasyon klas USP a etabli ak sa li pa etabli esplike kijan pou verifye dokiman an parapò ak deklarasyon an.

Chif la te kòrèk

Eksperyans 1928 ak 1930 yo te fèt avèk swen, epi obsèvasyon prensipal yo a toujou valab: yon koloran ki ka sibi rediksyon kapab fè yon selil ki prèske pa respire konsome oksijèn a yon vitès plizyè fwa pi wo pase vitès li nan repo, san li pa pase nan etap syanid bloke a.

Erè a parèt pi ta, lè yo li “respirasyon” ak sans modèn li. Yon mezi echanj gaz di w elektwon te rive jwenn oksijèn. Li pa di w yo te sèvi ak okenn ladan yo pou fè ATP, epi nan yon selil ki pa gen mitokondri, diferans ant de deklarasyon sa yo pi gwo toujou. Apèsi pi laj sou sa ble metilèn fè nan selil yo mete menm distenksyon an nan yon kad pi laj, epi istwa konpoze a soti nan koloran pou rive nan medikaman esplike kijan yon koloran tekstil te rive nan eksperyans sa yo an premye.