माइक्रोस्कोपी के लिए मेथिलीन ब्लू के विकल्प: कार्य के अनुसार चुनें

एक साधारण बैक्टीरियल स्मीयर में, यदि उद्देश्य कोशिकाओं का आकार देखना है तो मेथिलीन ब्लू की जगह क्रिस्टल वायलेट का उपयोग किया जा सकता है। जीवित कोशिकाओं के लिए बेहतर विकल्प बिना किसी स्टेन के फेज कॉन्ट्रास्ट हो सकता है। चुनाव इस बात पर निर्भर करता है कि आपको कौन-सा अवलोकन करना है।

मान लें कि दो लोग एक ही बैक्टीरियल कल्चर की जांच कर रहे हैं। एक व्यक्ति रॉड-आकार की कोशिकाओं को गोल कोशिकाओं से अलग पहचानना चाहता है। दूसरा जानना चाहता है कि किसी उपचार ने बैक्टीरिया को मारा है या नहीं। जो स्टेन पहले व्यक्ति को स्पष्ट छवि देता है, वह दूसरे व्यक्ति को उपयोगी उत्तर न भी दे सकता है।

विकल्प चुनने से पहले यह वाक्य पूरा करें: “मुझे ___ में ___ का अवलोकन करना है, और कोशिकाओं का जीवित रहना आवश्यक है / आवश्यक नहीं है।” यही वाक्य तय करता है कि स्टेन को कौन-सा काम करना है।

नमूने और प्रश्न से शुरुआत करें

पहले तय करें कि कोशिकाओं का जीवित रहना आवश्यक है या नहीं, फिर वह विशेषता पहचानें जिसका आपको अवलोकन करना है:

• कोशिकाओं का जीवित रहना आवश्यक है: गति या आकार के लिए बिना स्टेन वाला फेज कॉन्ट्रास्ट या DIC विचार करें; नाभिकीय DNA के लिए फ्लोरोसेंस के साथ Hoechst 33342 पर विचार करें; झिल्ली की अखंडता के लिए SYTO 9 और प्रोपिडियम आयोडाइड जैसे सत्यापित परीक्षण का चयन करें।
• कोशिकाओं का जीवित रहना आवश्यक नहीं है: बैक्टीरियल आकृति-विज्ञान के लिए क्रिस्टल-वायलेट साधारण स्टेन या निग्रोसिन नेगेटिव स्टेन पर विचार करें; ग्राम प्रतिक्रिया के लिए पूर्ण ग्राम-स्टेन विधि का उपयोग करें; स्थिर की गई कोशिकाओं में नाभिकीय DNA के लिए DAPI फ्लोरोसेंस पर विचार करें।

प्रत्येक विकल्प की सीमाओं की तुलना करने के लिए इस तालिका का उपयोग करें। ये विधि-चयन हैं, किसी मौजूदा प्रोटोकॉल में केवल एक बोतल को दूसरी से बदलने के निर्देश नहीं।

साधारण स्मीयर के लिए विधि को सावधानी से बदलें

जब कार्य बैक्टीरियल आकृति-विज्ञान का एकल-रंग दृश्य प्राप्त करना हो, तो क्रिस्टल वायलेट एक व्यावहारिक विकल्प है। FDA का Bacteriological Analytical Manual साधारण स्टेनिंग के लिए उपयुक्त दो क्रिस्टल-वायलेट फॉर्मुलेशन सूचीबद्ध करता है। दस्तावेजित फॉर्मुलेशन और उसकी तैयारी विधि का उपयोग करें; केवल डाई का नाम किसी कार्यशील अभिकर्मक को परिभाषित नहीं करता।

क्रिस्टल वायलेट ग्राम स्टेनिंग में भी उपयोग होता है, लेकिन इससे क्रिस्टल-वायलेट साधारण स्टेन ग्राम स्टेन नहीं बन जाता। ASM ग्राम-स्टेन प्रोटोकॉल में विभेदक परिणाम क्रिस्टल वायलेट, आयोडीन, डीकलराइजेशन और काउंटरस्टेनिंग के क्रमिक प्रभाव पर निर्भर करता है। इन चरणों को हटाने से यह बदल जाता है कि छवि से क्या स्थापित किया जा सकता है। इस अंतर के लिए साधारण स्टेनिंग बनाम ग्राम स्टेनिंग देखें।

निग्रोसिन रूपरेखा दिखाने का अलग तरीका प्रदान करता है: यह बैकग्राउंड को गहरा करता है जबकि बैक्टीरियल कोशिकाएं तुलनात्मक रूप से हल्की दिखाई देती हैं। Merck के निग्रोसिन निर्देशों में एक उपयोगी विवरण है जिसे विकल्पों की सामान्य सूची नजरअंदाज कर सकती है। इसके निर्दिष्ट कार्यशील फॉर्मुलेशन में फॉर्मल्डिहाइड शामिल है। इसलिए केवल “नेगेटिव स्टेन” शब्दों के आधार पर जीवित कोशिकाओं के साथ संगतता का निष्कर्ष नहीं निकाला जा सकता, भले ही कोशिकाएं स्वयं बिना स्टेन की दिखाई दें। पूरे फॉर्मुलेशन और नमूना-तैयारी की जांच करें।

जीवित नमूनों के लिए ऑप्टिक्स बदलने पर विचार करें

यदि आप कोशिकाओं को चलते या विभाजित होते देखना चाहते हैं, तो दूसरी डाई जोड़ने से अवलोकन अधिक जटिल हो सकता है। Nikon अपने पारदर्शी नमूनों में कॉन्ट्रास्ट संबंधी मार्गदर्शक में बताता है कि फेज कॉन्ट्रास्ट और डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कॉन्ट्रास्ट, यानी DIC, नमूनों के ऑप्टिकल गुणों में अंतर के माध्यम से उन्हें दृश्यमान बनाते हैं। यदि माइक्रोस्कोप में आवश्यक घटक हों, तो ये जीवित और बिना स्टेन वाली कोशिकाओं को दिखा सकते हैं।

यह विकल्प बिना स्टेन की तैयारी को बनाए रखता है, लेकिन उपलब्ध जानकारी बदल देता है। आप किसी सीमा या गति का अनुसरण कर सकते हैं, लेकिन यह नहीं जान सकते कि कॉन्ट्रास्ट किस अणु के कारण बना। यदि प्रश्न किसी अणु के स्थान-निर्धारण का है, तो इसके बजाय उपयुक्त लेबलिंग विधि चुनें।

नाभिकीय DNA के लिए Invitrogen की DAPI और Hoechst स्टेन की तुलना DAPI के स्थिर की गई कोशिकाओं में सामान्य उपयोग को अधिक कोशिका-पारगम्य Hoechst 33342 से अलग करती है, जिसे जीवित कोशिकाओं की लेबलिंग के लिए प्राथमिकता दी जाती है। दोनों के लिए फ्लोरोसेंस उपकरण आवश्यक हैं। इनमें से कोई भी रंगीन ब्राइटफील्ड स्टेन का प्रत्यक्ष विकल्प नहीं है।

डाई के संपर्क और प्रकाशन को प्रयोगात्मक परिस्थितियों के रूप में मानें। जब कोशिकाओं का व्यवहार आपका माप हो, तो स्टेन की गई और बिना स्टेन वाली तैयारियों की तुलना करें।

लाल कोशिका अपने-आप मृत कोशिका नहीं होती

बैक्टीरियल झिल्ली की अखंडता का आकलन करने के लिए SYTO 9 और प्रोपिडियम आयोडाइड को अक्सर साथ उपयोग किया जाता है। BacLight मैनुअल अखंड झिल्लियों को हरे स्टेन और क्षतिग्रस्त झिल्लियों को लाल स्टेन से जोड़ता है। इस व्याख्या को संबंधित नमूने के लिए सत्यापित करना आवश्यक है।

Rosenberg और सहकर्मियों के 2019 के एक अध्ययन से समस्या स्पष्ट होती है। फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन में कांच पर बने 24-hour E. coli बायोफिल्म में लगभग 96% कोशिकाएं वहीं पर प्रोपिडियम-आयोडाइड-पॉजिटिव दिखाई दीं। फिर भी लेखकों ने अनुमान लगाया कि संग्रह के बाद 82% कल्चर करने योग्य थीं। कॉन्फोकल छवियों में लाल-स्टेन सामग्री के नीचे हरे आंतरिक भाग वाली कोशिकाएं दिखाई दीं, जिससे भ्रामक संकेत में बाह्यकोशिकीय न्यूक्लिक एसिड की भूमिका का संकेत मिला।

ये प्रतिशत अध्ययन की तैयारियों पर किए गए अलग-अलग मापों का वर्णन करते हैं, किसी सार्वभौमिक सुधार-गुणांक का नहीं। उपयोगी निष्कर्ष यह है कि जांचें कि संकेत किससे उत्पन्न हुआ। बायोफिल्म में न्यूक्लिक-एसिड डाई क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के भीतर की सामग्री के साथ-साथ कोशिकाओं के बाहर की सामग्री का भी पता लगा सकती है। जीवितता संबंधी निष्कर्ष के लिए शोधकर्ता कल्चर या मेटाबोलिक गतिविधि जैसे पूरक मापों की अनुशंसा करते हैं, साथ ही यह स्वीकार करते हुए कि प्रत्येक की अपनी सीमाएं हैं।

जांचें कि विकल्प में वास्तव में क्या शामिल है

किसी वैकल्पिक स्टेनिंग विधि में फिर भी मेथिलीन ब्लू हो सकता है। Giemsa इसका एक उदाहरण है: Merck अपने उत्पाद को azure-eosin-methylene-blue solution के रूप में वर्णित करता है, जिसका उपयोग रक्त और बोन-मैर्रो स्मीयर सहित अनुप्रयोगों के लिए किया जाता है। यह किसी अलग नमूने के लिए अलग विधि हो सकती है, लेकिन मेथिलीन ब्लू को बाहर रखने की आवश्यकता पूरी नहीं करती।

यदि किसी यौगिक को बाहर रखना प्रयोग का हिस्सा है, तो छवियों की तुलना करने से पहले अभिकर्मक की पहचान और फॉर्मुलेशन की जांच करें। मिथाइल ब्लू, मेथिलीन ब्लू और समान नाम वाली डाइयों की मार्गदर्शिका नामकरण के अंतर समझाती है।

परिणाम का उपयोग करने से पहले प्रतिस्थापन सत्यापित करें

नई विधि के लिए प्रतिनिधि नमूनों और उपयुक्त नियंत्रण का उपयोग करके एक छोटी तुलना करें। जहां संभव हो, माइक्रोस्कोप सेटिंग्स को तुलनीय रखें। अभिकर्मक फॉर्मुलेशन, नमूना-तैयारी, एक्सपोजर और इमेजिंग परिस्थितियां दर्ज करें ताकि बेहतर दिखने वाली छवि को केवल पसंद करने के बजाय उसकी जांच की जा सके।

सफलता का आकलन मूल प्रश्न के आधार पर करें। आकृति-विज्ञान के लिए देखें कि कोशिका सीमाएं और व्यवस्था समझने योग्य बनी रहती हैं या नहीं। नाभिकीय लेबलिंग के लिए संकेत के स्थान और बैकग्राउंड का आकलन करें। जीवितता के लिए केवल आकर्षक रंग-विभाजन से आगे का साक्ष्य आवश्यक मानें। मेथिलीन ब्लू स्टेनिंग और प्रयोगशाला अनुप्रयोगों की विस्तृत मार्गदर्शिका बताती है कि अवलोकन और तैयारी एक-दूसरे से कैसे संबंधित हैं।

वही विकल्प चुनें जो आपके आवश्यक माप को सुरक्षित रखे। रंग परिणामी छवि का केवल एक गुण है।