क्या मेथिलीन ब्लू माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स III को बाइपास कर सकता है? अध्ययनों के निष्कर्ष अलग क्यों हैं

दो प्रयोगशालाओं ने पूछा कि क्या मेथिलीन ब्लू अवरुद्ध माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स III को बाइपास कर सकता है। एक ने कहा नहीं। दूसरी ने कहा हाँ। दोनों के पास डेटा था।

माउस के मस्तिष्क के माइटोकॉन्ड्रिया पर हुए पहले अध्ययन में पाया गया कि यह रंजक ऐसा नहीं कर सकता। कृंतकों की तीन प्रजातियों के मस्तिष्क के माइटोकॉन्ड्रिया पर हुए दूसरे अध्ययन में पाया गया कि यह आंशिक रूप से ऐसा कर सकता है। माउस के यकृत पर हुए तीसरे अध्ययन का उल्लेख अक्सर इसी संदर्भ में होता है, लेकिन उसने कुछ और जाँचा था। उसे सही संदर्भ में रखने से आधा भ्रम दूर हो जाता है।

यहाँ किसी सार्वभौमिक क्रियाविधि की घोषणा नहीं की जा सकती। यहाँ अलग-अलग अवरोधकों, मात्राओं और मापों वाले तीन प्रयोग हैं। पहले परिस्थितियाँ पढ़ें। निष्कर्ष उन्हीं से निकलते हैं।

यहाँ बाइपास का क्या अर्थ है

इलेक्ट्रॉन कॉम्प्लेक्स I के माध्यम से (NADH से) या कॉम्प्लेक्स II के माध्यम से (सक्सिनेट से) शृंखला में प्रवेश करते हैं, कॉम्प्लेक्स III से होकर साइटोक्रोम c तक पहुँचते हैं, फिर कॉम्प्लेक्स IV से होकर ऑक्सीजन तक जाते हैं। इस दौरान बनने वाली प्रवणता की ऊर्जा का उपयोग कोशिका ATP बनाने में करती है।

बाइपास का दावा यह है कि मेथिलीन ब्लू अवरोध से पहले इलेक्ट्रॉन ग्रहण करता है और उन्हें अवरोध के बाद पहुँचा देता है। ऑक्सीकृत रंजक NADH या शृंखला के शुरुआती घटकों से इलेक्ट्रॉन लेकर ल्यूकोमेथिलीन ब्लू बन जाता है, और उसका अपचयित रूप उन्हें साइटोक्रोम c को सौंप देता है या वापस शृंखला में डाल देता है। यदि इलेक्ट्रॉन अवरोध के बाद पहुँचते हैं, तो श्वसन और झिल्ली विभव आंशिक रूप से बहाल होते हैं। यदि वे अवरोध पर या उससे पहले पहुँचते हैं, तो कुछ भी बहाल नहीं होता।

कॉम्प्लेक्स III का एक विवरण इस विवाद के बड़े हिस्से को निर्धारित करता है। यह कॉम्प्लेक्स एक Q चक्र चलाता है, जिसमें अवरोधकों के लिए दो स्थल हैं। एंटीमाइसिन Qi स्थल से जुड़ता है। मिक्सोथियाज़ोल Qo स्थल से जुड़ता है। इनमें से केवल एक का उपयोग करने वाला अध्ययन कॉम्प्लेक्स के केवल आधे हिस्से को जाँचता है।

पहला अध्ययन: माउस के मस्तिष्क के माइटोकॉन्ड्रिया में बाइपास नहीं हुआ

Gureev और सहकर्मियों ने C57BL/6 माउस के मस्तिष्क के कॉर्टेक्स से माइटोकॉन्ड्रिया लिए, उन्हें डिजिटोनिन से अलग किया और 0.1 mg प्रोटीन प्रति ml पर परीक्षण किया। सब्सट्रेट की तीन व्यवस्थाएँ थीं: पाइरुवेट और मैलेट, प्रत्येक 5 mM; सक्सिनेट 10 mM के साथ ग्लूटामेट 2 mM; और L-प्रोलिन 10 mM। अवरोधक थे रोटेनोन 1 micromolar पर (कॉम्प्लेक्स I) और एंटीमाइसिन 1 microgram प्रति ml पर (कॉम्प्लेक्स III)। रंजक की मात्राएँ 0.5, 1 और 2 micromolar थीं, जिनमें 1 micromolar मुख्य सांद्रता थी। विधियाँ और मापन वक्र FEBS Letters के शोध संचार में दिए गए हैं।

कॉम्प्लेक्स I का बाइपास काम किया। रोटेनोन ने ADP द्वारा उत्तेजित श्वसन को लगभग 121 से घटाकर लगभग 2 nmol प्रति minute प्रति mg कर दिया, और 1 micromolar रंजक ने उसे लगभग 21 तक बहाल कर दिया। पाइरुवेट और मैलेट पर तथा L-प्रोलिन पर झिल्ली विभव बहाल हुआ।

कॉम्प्लेक्स III का बाइपास काम नहीं किया। एंटीमाइसिन ने श्वसन को लगभग 16 तक घटा दिया, और रंजक ने उसे केवल लगभग 20 तक बढ़ाया। रंजक की मात्रा 5 micromolar तक होने पर भी किसी सब्सट्रेट पर झिल्ली विभव बहाल नहीं हुआ। पेरॉक्साइड के डेटा ने भी इसी ओर संकेत किया: अकेले रंजक ने पेरॉक्साइड उत्सर्जन को लगभग 76 pmol प्रति minute प्रति mg की आधारभूत दर से बढ़ाकर तीनों मात्राओं पर लगभग 1170, 1460 और 1945 कर दिया, लेकिन एंटीमाइसिन ने रंजक से उत्पन्न उस संकेत को क्रमशः लगभग 25, 88 और 96 प्रतिशत घटा दिया। यदि अपचयित रंजक सीधे ऑक्सीजन से अभिक्रिया करता, तो कॉम्प्लेक्स III को अवरुद्ध करने से संकेत दबना नहीं चाहिए था। लेखकों ने निष्कर्ष निकाला कि अपचयित रंजक कॉम्प्लेक्स III के Qo स्थल पर ऑक्सीकृत होता है, जो एंटीमाइसिन के अवरोध से पहले है। शब्दों में छोटा चक्र: दाताओं से रंजक तक, रंजक से Qo तक, फिर सामान्य मार्ग से आगे। रोटेनोन का बाइपास होता है। एंटीमाइसिन का नहीं।

दूसरा अध्ययन: तीन प्रजातियों में, दोनों अवरोधक स्थलों पर आंशिक बाइपास

Svab और सहकर्मियों ने प्रयोग का दायरा बढ़ाया। माउस, रैट और गिनी पिग के मस्तिष्क से माइटोकॉन्ड्रिया लिए, उन्हें Percoll से अलग किया और उसी 0.1 mg प्रति ml पर परीक्षण किया। सब्सट्रेट पाइरुवेट और मैलेट या ग्लूटामेट और मैलेट थे, प्रत्येक 5 mM पर। उन्होंने कॉम्प्लेक्स III के दो अवरोधक इस्तेमाल किए: एंटीमाइसिन A 0.3 micromolar पर और मिक्सोथियाज़ोल 1 micromolar पर। अधिकांश परीक्षणों में रंजक 2 micromolar पर था और साइटोक्रोम c से संबंधित परीक्षणों में 0.5 पर। समान प्रोटोकॉल वाली तीनों प्रजातियों के परिणाम मुक्त पहुँच वाले शोधपत्र में हैं।

तीनों प्रजातियों में दोनों अवरोधों का आंशिक बाइपास हुआ। माउस के माइटोकॉन्ड्रिया में एंटीमाइसिन ने श्वसन दबाया और रंजक ने उसे लगभग 60 प्रतिशत बढ़ाया, लगभग 37 से 59 nmol प्रति minute प्रति mg तक। मिक्सोथियाज़ोल ने इसे 88 प्रतिशत दबाकर लगभग 4.5 कर दिया, और रंजक ने इसे पाँच गुना बढ़ाकर लगभग 23 कर दिया। दोनों में से किसी भी अवरोधक की उपस्थिति में झिल्ली विभव आंशिक रूप से फिर स्थापित हुआ। प्रकाशीय मापन संबंधी त्रुटियों को खारिज करने के लिए इसे दो रंजकों (सैफ्रानिन O और अनुपातमितीय TMRM) से मापा गया।

इस शोधपत्र ने इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण को सीधे भी जाँचा, जो पहले अध्ययन ने कभी नहीं किया था। बाहर से मिलाए गए एसीटिलित साइटोक्रोम c, 25 micromolar पर, का ऊर्जित माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा अपचयन नहीं हुआ, चाहे अवरोधक मौजूद हों या न हों। लेकिन रंजक मिलाने से दोनों स्थितियों में अपचयन हुआ। कोशिका रहित बफर में NADH और रंजक ने साइटोक्रोम c का अपचयन ऐसी दर से किया जो NADH के अनुपात में थी। शब्दों में लंबी छलाँग: अपचायक समतुल्यों से रंजक तक, रंजक से सीधे साइटोक्रोम c तक, कॉम्प्लेक्स IV से ऑक्सीजन तक। यह मार्ग कॉम्प्लेक्स III को पूरी तरह छोड़ देता है, इसलिए दोनों अवरोधकों का बाइपास संभव है।

दो अतिरिक्त माप इस व्याख्या का समर्थन करते हैं। मिक्सोथियाज़ोल से उपचारित माइटोकॉन्ड्रिया में रंजक मिलाने पर NAD(P)H प्रतिदीप्ति घटी, जिसका अर्थ है कि अपचायक समतुल्य नए मार्ग से निकल रहे थे। साथ ही, 660 nm पर रंजक का अवशोषण क्रमशः हर पदार्थ के मिलाए जाने पर होने वाले बदलावों को दर्शाता रहा। अपकेंद्रण के बाद प्राप्त अधिप्लवों ने दिखाया कि ऊर्जित माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर ऑक्सीकृत रंजक की सांद्रता सौ गुने से अधिक हो जाती थी और विभव ढहने पर वह बाहर निकल जाता था। प्रोटॉन का हिसाब भी इससे मेल खाता है: पंपिंग के चरण छोड़ने से प्रति इलेक्ट्रॉन जोड़ी 10 के बजाय लगभग 2 प्रोटॉन रह जाते हैं। इसलिए ऑक्सीजन का तेज़ उपयोग और केवल आंशिक पुनर्ध्रुवण वास्तविक बाइपास के अनुरूप हैं, उसके विरुद्ध प्रमाण नहीं।

उसी तैयारी में ऐसी प्रतिक्रियाएँ मिलीं जिन्हें सरसरी तौर पर पढ़ने से गलत निष्कर्ष निकल सकते हैं। अवरोधक और रंजक की उपस्थिति में ADP ने श्वसन बढ़ाने के बजाय घटाया, और परिवहन अवरुद्ध करने से यह धीमा होने के बजाय बढ़ा, जबकि झिल्ली विभव फिर भी सामान्य दिशाओं में बदला। इस प्रणाली में अकेली ऑक्सीजन खपत भ्रामक है।

तीसरा अध्ययन: यकृत के अध्ययन ने कॉम्प्लेक्स I और II को जाँचा, III को नहीं

Lee और Boelsterli ने माउस के यकृत के माइटोकॉन्ड्रिया और संवर्धित यकृत कोशिकाओं का उपयोग किया, जिन्हें एफाविरेंज़ (कॉम्प्लेक्स I, IC50 लगभग 30 micromolar) और आइसोनियाज़िड के चयापचय उत्पाद हाइड्राज़ीन (कॉम्प्लेक्स II, IC50 लगभग 30 micromolar) से क्षति पहुँचाई गई थी। लगभग 30 micromolar पर रंजक ने NADH ऑक्सीकरण, झिल्ली विभव और ATP बहाल किए, जबकि ऑक्सीकारकों और परिगलनजनित कोशिका मृत्यु को कम किया। Redox Biology का शोधपत्र इसे इस मॉडल से समझाता है कि रंजक क्षतिग्रस्त कॉम्प्लेक्स I और II को बाइपास करते हुए इलेक्ट्रॉन ले जाता है।

यह परिणाम शृंखला के पहले हिस्से का स्थापित संदर्भ है। यह कॉम्प्लेक्स III के बारे में कुछ नहीं कहता, क्योंकि इस प्रयोग में वहाँ कुछ भी अवरुद्ध नहीं किया गया था। यह मस्तिष्क के दोनों अध्ययनों में से किसी की भी पुष्टि या खंडन नहीं कर सकता।

परिस्थितियों की तुलना

चार कारण जिनसे कॉम्प्लेक्स III के दोनों अध्ययन अपने प्रयोग की परिस्थितियों के लिए सही हो सकते हैं

1. अवरोधकों का हस्तक्षेप एक जैसा नहीं था। एक तरफ अकेला एंटीमाइसिन 1 microgram प्रति ml पर था, दूसरी तरफ एंटीमाइसिन 0.3 micromolar पर और अलग से Qo स्थल का अवरोधक था। रंजक का वह मार्ग जो इलेक्ट्रॉनों को Qo स्थल तक पहुँचाता है, ठीक उसी स्थिति में विफल होता है जिसमें सीधे साइटोक्रोम c तक जाने वाला मार्ग सफल होता है। एक स्थल दोनों का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता।

2. रंजक की मात्रा और मापन का समय अलग थे। मुख्य सांद्रताएँ 1 और 2 micromolar थीं। यह ऐसा रेडॉक्स चक्रक है जिसका अवशोषण और साइटोक्रोम c का प्रत्यक्ष अपचयन सांद्रता तथा समय पर निर्भर करते हैं। मात्रा में छोटे अंतर और मापन के अलग समय एक ही नेटवर्क के अलग-अलग मार्गों को सामने ला सकते हैं।

3. माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारियाँ अलग थीं। डिजिटोनिन से पृथक्करण और Percoll प्रवणता से पृथक्करण माइटोकॉन्ड्रिया के ऐसे समूह चुनते हैं जो कुछ हद तक समान होते हैं, लेकिन पूरी तरह एक जैसे नहीं। प्रोटीन की सांद्रता दोनों में 0.1 mg प्रति ml थी, इसलिए यह चर अंतर की वजह नहीं बनता, लेकिन उपसमूह और संरचनात्मक अखंडता की संभावित भूमिका बनी रहती है। प्रजाति को लेकर संदेह भी दूर हुआ: दूसरे समूह ने माउस में भी वही प्रतिक्रिया दोहराई।

4. सब्सट्रेट की स्थिति तय करती है कि रंजक क्या कर सकता है। एक तरफ सब्सट्रेट की तीन व्यवस्थाएँ थीं, दूसरी तरफ NADH से जुड़े जोड़े। NADH की उपलब्धता और झिल्ली विभव मिलकर तय करते हैं कि रंजक कितनी तेज़ी से अपचयित होता है और किन स्थानों पर वितरित होता है। जिस मार्ग को ऑक्सीकृत साइटोक्रोम c के पास अपचयित रंजक चाहिए, वह इस चुनाव पर निर्भर है।

बाइपास के अगले दावे को कैसे पढ़ें

पूछें कि कौन-सा कॉम्प्लेक्स अवरुद्ध किया गया था, किस अवरोधक से, किस स्थल पर और किस मात्रा में। रंजक की सांद्रता और मापन का समय पूछें। ऊतक, प्रजाति, पृथक्करण विधि, प्रोटीन की सांद्रता और सब्सट्रेट पूछें। यह भी पूछें कि विभव, श्वसन, रेडॉक्स अवस्था और प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण परीक्षण के परिणाम आपस में मेल खाते हैं या नहीं, क्योंकि यहाँ अकेली ऑक्सीजन खपत ने एक से अधिक बार गलत दिशा में संकेत किया।

सीमित निष्कर्ष यही है। रंजक द्वारा कॉम्प्लेक्स I के बाइपास पर सहमति है। कॉम्प्लेक्स III के मामले में, एंटीमाइसिन 1 microgram प्रति ml और रंजक 1 micromolar पर माउस के माइटोकॉन्ड्रिया में कोई कार्यात्मक बाइपास नहीं दिखता। वहीं, एंटीमाइसिन 0.3 micromolar या मिक्सोथियाज़ोल 1 micromolar और रंजक 2 micromolar पर तीन प्रजातियों में आंशिक बाइपास दिखता है, जिसमें रंजक से सीधे साइटोक्रोम c तक इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण होता है। ये दोनों कथन एक साथ सही हो सकते हैं। इससे व्यापक कोई भी निष्कर्ष अध्ययन की परिस्थितियों से आगे का अनुमान है।

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