मेथिलीन ब्लू और कोशिकीय जीर्णता: फाइब्रोब्लास्ट प्रयोग क्या मापते हैं

एक आम गलत व्याख्या कुछ इस तरह होती है। किसी शोधपत्र में बताया जाता है कि मेथिलीन ब्लू ने संवर्धित फाइब्रोब्लास्ट की आबादी को 20 से अधिक अतिरिक्त बार दोगुना होने दिया, इसलिए पाठक निष्कर्ष निकाल लेता है कि यह जीर्ण कोशिकाओं को हटाता है या मानव जीवनकाल को भी उसी अनुपात में बढ़ाता है। यह निष्कर्ष स्वाभाविक लग सकता है। लेकिन यह दो अलग-अलग बिंदुओं पर गलत है।

मूल समस्या अवधारणा की है, संख्याओं की नहीं। आबादी के दोगुना होने की संख्या, जीर्णता के संकेतक और टेलोमियर के मापन अलग-अलग प्रश्नों का उत्तर देते हैं। मेथिलीन ब्लू पर फाइब्रोब्लास्ट संबंधी शोध को प्रयोगशाला की डिश में एक प्रकार की कोशिका के जीर्णता में देर से प्रवेश करने के अध्ययन के रूप में पढ़ना सबसे उचित है, जिसे माइटोकॉन्ड्रिया के मापनों से समर्थन मिलता है। यह पहले से जीर्ण हो चुकी कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से हटाने से अलग है, और पूरे जीव की उम्र बढ़ने से भी अलग है। इस अंतर का व्यापक संदर्भ माइटोकॉन्ड्रिया में इलेक्ट्रॉन परिवहन कोशिका की ऊर्जा को कैसे प्रभावित करता है और मेथिलीन ब्लू संबंधी शोध के दावों की व्याख्या से जुड़ा है।

आबादी के दोगुना होने की संख्या उसका इतिहास बताती है, उसकी युवावस्था नहीं

अधिकांश प्रमुख परिणाम IMR90 कोशिकाओं से आते हैं। यह सामान्य मानव भ्रूणीय फेफड़े के फाइब्रोब्लास्ट का एक स्ट्रेन है, जिसकी विभाजन क्षमता सीमित होती है। IMR90 फाइब्रोब्लास्ट में मेथिलीन ब्लू और विभाजनशील जीवनकाल के शुरुआती अध्ययन में कल्चरों को तय समय-सारणी के अनुसार नई डिशों में स्थानांतरित किया गया और कल्चर का विभाजन रुकने तक आबादी के दोगुना होने की संचयी संख्या दर्ज की गई। नैनोमोलर स्तरों पर, मुख्यतः 100 nM के आसपास, उपचार से कल्चर विभाजन रुकने से पहले 20 से अधिक अतिरिक्त बार दोगुने हो सके।

आबादी का एक बार दोगुना होना गणना की एक इकाई है। यह दर्ज करता है कि आबादी लगभग कितनी बार दोगुनी हुई है। इससे सीधे यह नहीं पता चलता कि कोई व्यक्तिगत कोशिका जीर्ण, अस्थायी रूप से निष्क्रिय, विभेदित या मृत है। किसी कल्चर में दोगुना होने की संख्या इसलिए बढ़ सकती है कि कोशिकाएं अधिक समय तक विभाजन करने में सक्षम रहती हैं, तनाव के कारण कम कोशिकाओं का विभाजन समय से पहले रुकता है, या परिस्थितियां अधिक विभाजन करने वाली किसी उप-आबादी को बढ़ावा देती हैं। केवल यह संख्या इन संभावनाओं को अलग नहीं कर सकती।

इसीलिए दोगुना होने की संख्या के साथ संकेतकों को भी देखा जाता है। यह संख्या बताती है कि कोशिका वृद्धि कितने समय तक चली। संकेतक बताते हैं कि जिन कोशिकाओं का विभाजन रुका या जो जीवित रहीं, वे किस अवस्था में पहुंचीं।

मापन की मार्गदर्शिका: प्रत्येक संकेतक क्या बताता है

कल्चर में जीर्णता एक ऐसा फीनोटाइप है, जिसकी पहचान कई स्वतंत्र मापनों को साथ देखकर की जाती है। कोई एक अभिरंजन या प्रोटीन इसे साबित नहीं करता।

DNA संश्लेषण समाप्त होने के साथ वृद्धि का रुकना। स्थायी रुकावट की जांच BrdU या EdU के घटे हुए समावेशन, चपटी कोशिकीय आकृति और दोबारा प्लेट पर लगाने के बाद फिर से वृद्धि न होने से की जाती है। इससे जीर्णता के कारण हुए विभाजन के रुकने को अस्थायी निष्क्रियता से अलग किया जाता है।

जीर्णता से संबद्ध बीटा-गैलेक्टोसिडेज़। SA-beta-gal अभिरंजन लगभग pH 6.0 पर लाइसोसोम की गतिविधि दिखाता है। जीर्ण फाइब्रोब्लास्ट में लाइसोसोम का कुल द्रव्यमान बढ़ने पर अक्सर सकारात्मक अभिरंजन मिलता है। यह जीर्णता के लिए विशिष्ट नहीं है, इसलिए इसे कोशिका वृद्धि और आणविक संकेतकों के साथ पढ़ा जाता है।

p16 और p21 मार्ग। p16, CDK4 और CDK6 तथा RB मार्ग के जरिए काम करता है। p21 का उत्पादन अक्सर p53 के जरिए प्रेरित होता है। इनके बढ़ते स्तर विभाजन के रुकने का समर्थन करते हैं, लेकिन इनमें से कोई भी प्रोटीन केवल जीर्णता से संबंधित नहीं है।

स्रावी अवस्था। जीर्णता से संबद्ध स्रावी फीनोटाइप, या SASP, साइटोकाइन, केमोकाइन, वृद्धि कारकों और प्रोटीएज़ के स्राव में बदलाव को दर्शाता है। SASP कारकों के RNA या प्रोटीन परीक्षण बताते हैं कि कोशिकाएं पड़ोसी कोशिकाओं को कैसे संकेत देती हैं। वे विभाजन क्षमता को सीधे नहीं मापते।

ऑक्सीडेंट और माइटोकॉन्ड्रिया के मापन। मेथिलीन ब्लू के शोधपत्र माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़े मापन भी शामिल करते हैं: कॉम्प्लेक्स IV की मात्रा और गतिविधि, ऑक्सीजन की खपत, हीम संश्लेषण, झिल्ली का द्रव्यमान, झिल्ली विभव, ATP और ऑक्सीडेंट संकेत। ये उस चयापचयी अवस्था का वर्णन करते हैं जो विभाजन के देर से रुकने के साथ दिखाई देती है। ये अपने आप में जीर्णता को परिभाषित नहीं करते, लेकिन प्रस्तावित तंत्र की जांच करते हैं। रेडॉक्स चक्रण का मॉडल, जिसमें NAD(P)H मेथिलीन ब्लू को अपचयित करता है और साइटोक्रोम c उसे फिर से ऑक्सीकृत करता है, उसी IMR90 अध्ययन में समझाया गया है जो रेडॉक्स चक्रण को कम ऑक्सीडेंट उत्पादन से जोड़ता है। खुराक और वितरण से संबंधित तर्क मेथिलीन ब्लू के औषधिविज्ञान और ऊतकों तक उसके पहुंचने की चर्चा में शामिल हैं।

टेलोमियर क्षरण की दर। सही इकाई कई सप्ताह के दौरान प्रति बार आबादी के दोगुना होने पर खोए गए बेस पेयर हैं, किसी एक समय-बिंदु पर लंबाई नहीं। धीमे क्षरण का मतलब प्रत्येक प्रतिकृति चक्र में कम छोटा होना है। इसका मतलब लंबा होना नहीं है, और तनाव IMR90 कोशिकाओं का विभाजन टेलोमियर में बहुत कम बदलाव के साथ भी रोक सकता है।

फाइब्रोब्लास्ट के तीन प्रयोगात्मक डिज़ाइनों की तुलना

इस पृष्ठ के लिए तैयार की गई मूल सामग्री नीचे दी गई तुलना है। इसमें कोशिका का प्रकार, संपर्क, मापन और सीमा एक साथ दिखाई देते हैं।

किसी एक पंक्ति से अधिक महत्वपूर्ण सभी पंक्तियों में दिखाई देने वाला पैटर्न है। कम खुराक वाला मेथिलीन ब्लू बार-बार लंबे समय तक कोशिका वृद्धि, अधिक कॉम्प्लेक्स IV गतिविधि, कम ऑक्सीडेंट संकेत और बेहतर कोशिकीय आकृति से जुड़ा मिलता है। प्रयोगों का डिज़ाइन समय के साथ अनुवर्ती मापन वाला रहता है: विभाजित होती कोशिकाओं से शुरू करें, उनकी संख्या बढ़ने के दौरान उपचार दें और दर्ज करें कि विभाजन कितने समय तक जारी रहता है। यह संरचना जीर्णता को देर से शुरू करने के दावे का समर्थन कर सकती है। अलग डिज़ाइन के बिना यह कोशिकाओं को हटाने के दावे का समर्थन नहीं कर सकती।

जीर्णता को देर से शुरू करना जीर्ण कोशिकाओं को हटाना नहीं है

देर से शुरू होने का अर्थ है कि विभाजित होती कोशिकाएं अपना विभाजन रुकने से पहले अधिक समय तक विभाजित होती रहती हैं। हटाने का अर्थ, जिसे अक्सर सेनोलाइटिक प्रभाव कहा जाता है, यह है कि पहले से जीर्ण कोशिकाएं चुनिंदा रूप से मारी जाती हैं या उनकी संख्या घटाई जाती है, जबकि पड़ोस की वृद्धि करती कोशिकाएं जीवित रहती हैं।

मेथिलीन ब्लू से संबंधित फाइब्रोब्लास्ट साहित्य पहली संरचना की जांच करता है। कल्चर शुरुआत में वृद्धि कर रहे होते हैं, क्रमिक पैसेज के दौरान उन्हें उपचार मिलता है और उनका विभाजन बाद में रुकता है। इसलिए SA-beta-gal, p16, p21 और SASP कारकों जैसे संकेतक बाद में दिखाई देते हैं या किसी निश्चित पैसेज पर कम स्तरों पर मिलते हैं। जब भी जीर्णता की शुरुआत का समय आगे खिसकता है, ऐसा पैटर्न अपेक्षित होता है। इससे यह साबित नहीं होता कि पहले से जीर्ण हो चुकी कोई कोशिका हटाई गई।

सेनोलाइटिक दावे के लिए अलग व्यवस्था चाहिए: पहले किसी कल्चर को सत्यापित जीर्ण अवस्था में पहुंचाएं, फिर यौगिक दें और उसके बाद कोशिका वृद्धि वाले नियंत्रणों की तुलना में उन जीर्ण कोशिकाओं की चुनिंदा हानि दिखाएं, साथ में जीवित रहने की क्षमता और मृत्यु के प्रत्यक्ष मापन भी हों। केवल किसी संकेतक का घटना पर्याप्त नहीं है, क्योंकि कोशिकाओं की हानि के बिना भी अभिव्यक्ति बदल सकती है और बची हुई वृद्धि करती कोशिकाएं बढ़कर डिश में हावी हो सकती हैं। उद्धृत चारों स्रोतों में से कोई भी मेथिलीन ब्लू के लिए चुनिंदा कोशिका कमी वाले इस डिज़ाइन का उपयोग नहीं करता। इसलिए सटीक वर्णन अब भी इन विट्रो जीर्णता को देर से शुरू करने वाली या जीर्णता-रोधी गतिविधि है, सेनोलाइटिक गतिविधि नहीं। इस अंतर के ऑक्सीडेटिव तनाव संबंधी पहलू को कोशिकाएं प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को कैसे नियंत्रित करती हैं में आगे समझाया गया है।

क्षणिक संकेत प्रक्रिया का परिणाम इस बात को और स्पष्ट करता है। 2015 के IMR90 अध्ययन में मेथिलीन ब्लू से NAD और NADH के अनुपात में थोड़े समय के लिए वृद्धि हुई और AMPK का थोड़े समय के लिए फॉस्फोराइलेशन हुआ। इसके बाद PGC-1alpha और SURF1 का प्रेरण हुआ, जो दोनों कॉम्प्लेक्स IV के जैवजनन से जुड़े हैं। AICAR के साथ लंबे समय तक AMPK सक्रिय करने पर आबादी के अतिरिक्त बार दोगुना होने के मामले में परिणाम काफी कमजोर थे।

विभाजनशील जीवनकाल मानव दीर्घायु नहीं है

कोशिका का विभाजनशील जीवनकाल नियंत्रित डिश में, निश्चित ऑक्सीजन, संवर्धन माध्यम और पैसेज की समय-सारणी के साथ, विभाजन रुकने से पहले आबादी के दोगुना होने की संख्या गिनता है। मानव दीर्घायु में दशकों का विकास, प्रतिरक्षा, रक्तवाहिका तंत्र, स्टेम कोशिकाओं के सूक्ष्म परिवेश, व्यवहार और रोग शामिल होते हैं। कोई यौगिक पहले को बढ़ा सकता है, जबकि दूसरे में कोई बदलाव न आए, और अधिकांश के साथ ऐसा ही होता है।

प्रोजेरिया फाइब्रोब्लास्ट में एक निश्चित LMNA उत्परिवर्तन होता है, जो प्रोजेरिन बनाता है। इन कोशिकाओं में खंडित और कम गतिशील माइटोकॉन्ड्रिया, कम ATP, विकृत केंद्रक और हेटेरोक्रोमैटिन की हानि होती है। नैनोमोलर मेथिलीन ब्लू ने माइटोकॉन्ड्रिया संबंधी मापनों में सुधार किया और केंद्रक संबंधी मापनों को काफी हद तक सामान्य स्थिति की ओर लौटाया, जिसमें झिल्ली से प्रोजेरिन का अलग होना भी शामिल था। यह कोशिका स्तर पर उल्लेखनीय सुधार है। फिर भी यह फाइब्रोब्लास्ट का परिणाम है, और लेखकों ने पशु परीक्षण को भविष्य के काम के रूप में रखा। रोग के इस मॉडल की आगे चर्चा प्रोजेरिया और कोशिकाओं की समयपूर्व उम्र बढ़ने के मॉडलों में मेथिलीन ब्लू में की गई है।

इससे शोध पढ़ने के लिए एक व्यावहारिक जांच-सूची निकलती है।

1. पूछें कि उपचार विभाजन रुकने से पहले शुरू हुआ था या विभाजन का रुकना स्थापित हो जाने के बाद। पहले शुरू होना देरी का समर्थन करता है। हटाने के लिए बाद में शुरू हुआ उपचार और चुनिंदा मृत्यु के आंकड़े चाहिए।
2. पूछें कि नियंत्रण समूह में आबादी के दोगुना होने के वक्र ने क्या दिखाया। संचयी दोगुना होने की संख्या के बिना संकेतकों के बदलाव का आधार स्पष्ट नहीं रहता।
3. केवल एक अभिरंजन के बजाय कम से कम दो वर्गों के संकेतक मांगें, जैसे कोशिका वृद्धि का लेबल, साथ में p16 या p21 और SA-beta-gal।
4. पूछें कि टेलोमियर के परिणाम कैसे बताए गए। समय के साथ प्रति बार आबादी के दोगुना होने की दर अर्थपूर्ण होती है। किसी एक समय पर लंबाई का मापन नहीं।
5. पूछें कि क्या स्थिर रखा गया था। पैसेज के समय कोशिका घनत्व, ऑक्सीजन, संवर्धन माध्यम में बदलाव और मेथिलीन ब्लू के ताज़ा बनाम पुराने स्टॉक घोल, सभी फाइब्रोब्लास्ट के विभाजन रुकने को प्रभावित करते हैं।

इस तरह पढ़ने पर फाइब्रोब्लास्ट साहित्य मेथिलीन ब्लू की एक सुसंगत लेकिन सीमित भूमिका दिखाता है: कम खुराक में इस्तेमाल किया गया एक रेडॉक्स-सक्रिय यौगिक, जो संवर्धित मानव फाइब्रोब्लास्ट में विभाजन-संबंधी जीर्णता को देर से शुरू करता है और माइटोकॉन्ड्रिया के मापनों में सुधार लाता है। इसके तंत्र का सबसे ठोस विवरण क्षणिक ऊर्जा संकेत प्रक्रिया और कॉम्प्लेक्स IV के जैवजनन से जुड़ा है। इन शोधपत्रों में जीर्ण कोशिकाओं के निष्कासन या मानव जीवनकाल बढ़ने का कोई प्रदर्शन नहीं है।