मेथिलीन ब्लू का अवशोषण सांद्रता के साथ क्यों बदलता है

मेथिलीन ब्लू के स्टॉक विलयन की एक बोतल लें और उससे दो गिलास भरें। पहले गिलास में सीधे स्टॉक विलयन डालें और दूसरे में दस गुना तनु किया हुआ विलयन। उम्मीद के मुताबिक, दूसरे गिलास का रंग हल्का होगा। ध्यान से देखने पर एक और बदलाव दिखेगा। रंग की आभा बदल गई है। एक विलयन साफ़ आसमानी नीले रंग की ओर झुकता है और दूसरा बैंगनी आभा वाले नीले रंग की ओर। तनुकरण ने केवल रंग की तीव्रता कम नहीं की। उसने यह भी बदल दिया कि अवशोषण में किस रासायनिक स्पीशीज़ का सबसे अधिक योगदान है।

इस बदलाव के पीछे की अवधारणा सरल है। घुला हुआ मेथिलीन ब्लू केवल एक स्पीशीज़ के रूप में नहीं रहता। रंजक का अकेला धनायन, जिसे एकलक कहते हैं, दूसरे धनायन के साथ आमने-सामने जुड़कर द्विलक बना सकता है, और द्विलक मिलकर बड़े समुच्चय बना सकते हैं। हर रूप का अपना अवशोषण स्पेक्ट्रम होता है। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर जो माप देता है, वह उन परिस्थितियों में उस क्यूवेट में मौजूद मिश्रण के सभी घटकों का संयुक्त योगदान होता है। मिश्रण बदलने पर स्पेक्ट्रम भी बदलता है, भले ही रंजक की कुल मात्रा सीधे तनुकरण अनुपात के अनुसार बदल रही हो।

एकलक और द्विलक अलग-अलग तरह से अवशोषण करते हैं

एकलक की कल्पना एक सपाट कार्ड के रूप में करें, जिसके वलय तंत्र में धन आवेश फैला हो। ऐसे दो कार्ड आमने-सामने टिक सकते हैं। धन आवेश एक-दूसरे को प्रतिकर्षित करते हैं, लेकिन सपाट ऐरोमैटिक सतहें स्टैकिंग अंतःक्रियाओं के कारण एक-दूसरे को आकर्षित करती हैं। आसपास का पानी और प्रतिआयन इस प्रतिकर्षण को कम करते हैं। इससे साझा इलेक्ट्रॉनिक अवस्थाओं वाला एक बंधित युग्म बनता है। इसके अनुमत संक्रमण एकलक के संक्रमण की तुलना में अधिक ऊर्जा पर होते हैं, इसलिए द्विलक का बैंड एकलक के बैंड से कम तरंगदैर्घ्य पर दिखाई देता है। बड़े समुच्चय नीली ओर और आगे योगदान देते हैं, जो बैंड के किनारे पर एक उभार के रूप में दिखाई देता है।

स्वच्छ पानी में बहुत कम सांद्रता पर एकलक प्रमुख होते हैं और अधिक तरंगदैर्घ्य वाला बैंड हावी रहता है। कुल सांद्रता बढ़ने पर युग्मित रूप का हिस्सा बढ़ता जाता है और पहले बैंड की तुलना में कम तरंगदैर्घ्य वाला बैंड अधिक प्रबल होता है। इसलिए दोनों बैंडों का अनुपात मिश्रण की संरचना बताता है, सीधे कुल सांद्रता नहीं। कौन-सा रूप मौजूद है, इसकी कोई मान्यता अपनाए बिना एक ही तरंगदैर्घ्य पर किया गया मापन दोनों को अलग नहीं कर सकता।

इसीलिए संदर्भ स्पेक्ट्रम के साथ उसकी परिस्थितियाँ हमेशा दी जानी चाहिए। मेथिलीन ब्लू का स्पेक्ट्रमी संदर्भ बैंडों की स्थितियों के साथ वह विलायक, लवण की पृष्ठभूमि, pH, तापमान और सांद्रता सीमा भी सारणीबद्ध करता है जिनमें वे प्राप्त हुए थे। इन परिस्थितियों के बिना किसी शिखर का मान बताने पर आवश्यक जानकारी अधूरी रहती है। एक ही रंजक से अलग-अलग स्पेक्ट्रम प्राप्त करने वाली दो प्रयोगशालाएँ, दोनों सही हो सकती हैं, क्योंकि उन्होंने अलग-अलग मिश्रणों को मापा था।

साम्य को क्या बदलता है

सांद्रता मुख्य कारक है। द्विलक बनने के लिए दो एकलकों का मिलना आवश्यक है, इसलिए कुल रंजक के साथ इसका हिस्सा रैखिक वृद्धि से अधिक तेज़ी से बढ़ता है। कमरे के तापमान के आसपास जलीय विलयनों के लिए प्रकाशित द्विलकीकरण स्थिरांक प्रति molar कई हज़ार के स्तर पर हैं, इसलिए micromolar सीमा में द्विलक का हिस्सा तेज़ी से बढ़ता है। micromolar से millimolar रंजक सांद्रता तक फैले व्यापक वैश्विक फिट में 34 micromolar से नीचे भी चतुष्लक का अशून्य योगदान मिला। इससे संकेत मिलता है कि दसियों micromolar पर केवल दो स्पीशीज़ वाले फिट पर भरोसा करने में सावधानी चाहिए। सटीक अंश माध्यम पर निर्भर करते हैं, इसलिए यह लेख बदलाव की दिशाएँ बताता है, कोई सार्वभौमिक रूपांतरण तालिका नहीं देता।

लवण दूसरा कारक है। घुले हुए आयन दो धनायनों के बीच प्रतिकर्षण को कम करते हैं, इसलिए सोडियम क्लोराइड और इसी तरह के अन्य इलेक्ट्रोलाइट मिलाने पर, समान रंजक सांद्रता में भी मिश्रण द्विलकों और समुच्चयों की ओर बढ़ता है। यह प्रभाव लवणीय और जलीय माध्यमों में मेथिलीन ब्लू के समुच्चयन पर किए गए अध्ययनों में दिखाई देता है। इनमें लगभग 1 micromolar से 3.4 millimolar तक के रंजक को 0 से 0.15 molar सोडियम क्लोराइड की सीमा में मापा गया। उस फिट में अधिक रंजक और अधिक लवण वाली स्थिति में चतुष्लक का अंश लगभग 0.93 तक पहुँचा। इसलिए पानी में दर्ज स्पेक्ट्रम और शारीरिक लवणीय विलयन में दर्ज स्पेक्ट्रम को एक-दूसरे के स्थान पर मानक के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता।

तापमान विपरीत दिशा में प्रभाव डालता है। स्टैकिंग से बंधित पानी मुक्त होता है, और तापीय गति स्टैकिंग का विरोध करती है। इसलिए विलयन को गर्म करने पर आम तौर पर कुछ द्विलक विघटित होकर फिर एकलक बन जाते हैं, जबकि ठंडा करने पर संघटन को बढ़ावा मिलता है। फिट से प्राप्त वियोजन एन्थैल्पी ऋणात्मक है, 282 से 333 kelvin की सीमा में लगभग ऋण 30 kilojoules per mole, जो संघटन के ऊष्माक्षेपी होने की पुष्टि करती है। प्रशीतन के तुरंत बाद मापा गया ठंडा नमूना, कमरे के तापमान पर साम्य स्थापित होने के बाद मापे गए उसी नमूने की तुलना में अधिक समुच्चयित दिखाई दे सकता है।

विलायक आधारभूत स्थिति तय करता है। पानी अपने प्रबल जलविरागी प्रभाव के कारण रंजक के सपाट धनायनों को स्टैक करने के लिए प्रेरित करता है। एथेनॉल और मेथेनॉल जैसे ऐल्कोहॉल वलयों का बेहतर विलायकीकरण करते हैं और समुच्चयों को तोड़ते हैं। इसलिए समान रंजक सांद्रता पानी की तुलना में एथेनॉल में अधिक एकलक-प्रधान दिखाई देती है। अप्रोटिक सह-विलायक भी ऐसा करते हैं: 293 kelvin पर पानी और DMSO के मिश्रणों में अतिरिक्त DMSO ने द्विलकीकरण को दबाया। इससे संकेत मिलता है कि पानी की संरचना स्टैकिंग का एक प्रेरक कारक है। पृष्ठसक्रिय पदार्थों के दोनों प्रकार के प्रभावों पर ध्यान देना आवश्यक है। उनकी क्रांतिक मिसेल सांद्रता से ऊपर, मिसेल एकलकों को अलग-अलग घुलनशील बनाए रख सकते हैं और एकलक जैसा स्पेक्ट्रम बहाल कर सकते हैं। इस सीमा से नीचे, विपरीत आवेश वाला पृष्ठसक्रिय पदार्थ इसके बजाय स्टैकिंग को बढ़ावा दे सकता है: 100 micromolar रंजक पर, SDS से प्रेरित बहुलकीकरण लगभग 4 millimolar SDS के पास चरम पर पहुँचा, जो मिसेल बनने की सीमा का लगभग आधा था। पृष्ठसक्रिय पदार्थ की अधिक मात्रा पर पुनर्वितरण हुआ। मेथिलीन ब्लू के स्पेक्ट्रम पर रंजक-विलायक और संगठित माध्यमों के प्रभावों पर किया गया कार्य दिखाता है कि देखे जाने वाले बैंडों को केवल समग्र सांद्रता नहीं, बल्कि अणु का निकटवर्ती परिवेश कितनी गहराई से प्रभावित करता है।

pH का महत्व मुख्यतः चरम सीमाओं पर होता है। अधिकांश प्रयोगशाला कार्यों में इस्तेमाल होने वाली लगभग उदासीन सीमा में मेथिलीन ब्लू अपने परिचित नीले धनायनिक रूप में रहता है और स्पेक्ट्रम के बदलाव में समुच्चयन प्रमुख भूमिका निभाता है। प्रबल अम्ल या क्षार, रंगहीन ल्यूको रूप बनाने वाली रेडॉक्स रसायनिकी, या प्रोटीन और कणों से बंधन, इनमें से प्रत्येक एकलक-द्विलक युग्म के अतिरिक्त अवस्थाएँ जोड़ता है। बफ़र मिलाने के बाद स्पेक्ट्रम बदलने पर, हर बदलाव का कारण केवल pH मानने से पहले बफ़र की संरचना में लवण और बंधन करने वाले घटकों की जाँच करें। रसायनिकी और प्रोटॉनीकरण का संदर्भ रासायनिक पहचान से जुड़े इन प्रश्नों को यहाँ विवेचित समुच्चयन के प्रश्न से अलग रखता है।

बीयर-लैम्बर्ट की सीधी रेखा क्यों मुड़ती है

बीयर-लैम्बर्ट संबंध के अनुसार अवशोषकता, अवशोषण गुणांक, सांद्रता और प्रकाश पथ की लंबाई के गुणनफल के बराबर होती है। यह गणना का नियम है। यह मानता है कि जिन वस्तुओं की गणना हो रही है, उनकी संख्या बदलने पर उनकी पहचान समान रहती है: केवल एक अवशोषक स्पीशीज़ हो, स्पेक्ट्रम स्थिर हो, सांद्रता के साथ कोई रासायनिक बदलाव न हो, मापन का प्रकाश एकवर्णी हो, प्रकीर्णन या पुनः उत्सर्जन न हो, और प्रकाश वास्तव में बताए गए पथ से गुज़रे।

समुच्चयन पहली मान्यता को तोड़ देता है। गणितीय रूप से, कुल अवशोषकता अब भी सभी स्पीशीज़ के योगदान का योग रहती है: प्रकाश पथ की लंबाई गुणा प्रत्येक स्पीशीज़ का अवशोषण गुणांक गुणा उसकी अपनी सांद्रता। प्रत्येक स्पीशीज़ इस नियम का पालन करती है। मिश्रण नहीं करता, क्योंकि स्पीशीज़ की सांद्रताएँ कुल रंजक की अरैखिक फलन होती हैं। इसलिए कुल रंजक के सापेक्ष एकलक बैंड पर अवशोषकता का अंशांकन वक्र अत्यधिक तनु सीमा में सीधा शुरू होता है और सांद्रता बढ़ने पर नीचे की ओर मुड़ता है। ऐसा इसलिए होता है कि हर अतिरिक्त वृद्धि के साथ अनुपाततः कम एकलक जुड़ते हैं। द्विलक बैंड पर मापा गया वक्र विपरीत दिशा में मुड़ता है। समुच्चयन संबंधी कार्य देखे गए लैम्बर्ट-बीयर विचलनों का कारण इसी तंत्र को बताते हैं। मुड़े हुए क्षेत्र में सीधी रेखा फिट करना और फिर उससे बहिर्वेशन करना एक प्रचलित त्रुटि है। रेखा केवल उसी सीमा और मैट्रिक्स में मान्य होती है जिसमें उसे बनाया गया था।

तनुकरण से एक संबंधित समस्या पैदा होती है। उपकरण की मापन सीमा तक पहुँचने के लिए सांद्र स्टॉक को तनु करने पर स्पीशीज़ का अनुपात सुरक्षित नहीं रहता। तनु क्यूवेट में साम्य एकलक की ओर फिर स्थापित होता है, इसलिए उसका स्पेक्ट्रम तनु नमूने का सही वर्णन करता है, लेकिन स्टॉक का गलत वर्णन करता है। अवशोषकता के मानों को बढ़ाकर स्टॉक के स्पेक्ट्रम की उलटी गणना से कुल मात्रा का अनुमान तभी सही मिलता है, जब अंशांकन में इस बदलाव को पहले से शामिल किया गया हो। इससे मूल बैंड का आकार कभी बहाल नहीं होता। सांद्र विलयन के स्पेक्ट्रम की तुलना तनु संदर्भ से करने वाला व्यक्ति दो अलग-अलग मिश्रणों की तुलना कर रहा होता है।

प्रकाश पथ की लंबाई परिणाम का हिस्सा है

अवशोषकता नमूने में प्रकाश द्वारा तय की गई दूरी के अनुपात में बदलती है। समान विलयन रखने पर 10 mm क्यूवेट, 1 mm क्यूवेट की तुलना में दस गुनी अवशोषकता देता है। यह अनुपात केवल समान विलयन के लिए सटीक है, और समुच्चयन के कारण यह शर्त निर्णायक हो जाती है।

व्यवहार में, प्रकाश पथ की लंबाई मान्य सीमा में रहने का एक साधन है। लंबा पथ तनु, मुख्यतः एकलक वाले विलयनों के लिए संवेदनशीलता देता है। छोटा पथ किसी सांद्र नमूने को मापन सीमा में रखता है, बिना बड़े तनुकरण चरण के जो साम्य को फिर बदल दे। ऊपर दिए गए आँकड़ों के पीछे के समुच्चयन अध्ययन में ठीक यही किया गया: 1.1 से 34 micromolar रंजक के लिए 1 centimeter सेल, और 94 micromolar से 3.4 millimolar के लिए 0.01 centimeter सेल। सूक्ष्म आयतन वाले मापन पेडेस्टल और प्लेट रीडर अपनी अलग ज्यामिति जोड़ते हैं। इनमें छोटे और कभी-कभी परिवर्तनशील पथ होते हैं, साथ ही ऐसी सतहें भी होती हैं जिन पर धनायनिक रंजक अधिशोषित हो सकता है। माप के साथ पथ की लंबाई बताएँ, जैसे स्पेक्ट्रमी संदर्भ में विलायक और लवण बताए जाते हैं। प्रकाश पथ की लंबाई के बिना अवशोषकता कोई परिणाम नहीं है। वह केवल एक अपुष्ट कथन है।

मापन की सावधानियाँ इसी तंत्र से निकलती हैं। मापन से पहले नमूनों को एक ही तापमान पर साम्य में आने दें। समान प्रकार और अभिविन्यास वाले क्यूवेट, समान लवण और बफ़र पृष्ठभूमि वाले मिलान किए गए ब्लैंक, और साफ़ काँच के उपकरण इस्तेमाल करें। मेथिलीन ब्लू काँच और प्लास्टिक पर अधिशोषित होता है, इसलिए रंजक लगा क्यूवेट पिछले सांद्र नमूने का अवशेष बनाए रखता है। जहाँ समुच्चयन की गतिकी मायने रखती है, वहाँ तैयारी के तुरंत बाद मापन करें। प्रत्येक अंशांकन वक्र उसी मैट्रिक्स और उसी प्रकाश पथ की लंबाई पर बनाएँ जो अज्ञात नमूनों के लिए इस्तेमाल होगी। दृश्य जाँच में याद रखें कि आँख एक खराब स्पेक्ट्रोमीटर है। क्या विलयन का रंग शुद्धता स्थापित कर सकता है, यह एक अलग प्रश्न है जिसका उत्तर नहीं है। समुच्चयन से होने वाले रंग की आभा के बदलाव इसका एक कारण हैं।

उपकरण के पास रखने के लिए एक आरेख

नीचे का चित्र इस लेख को प्रयोगशाला की कार्यमेज़ पर इस्तेमाल करने योग्य एक संदर्भ में समेटता है। तीनों विलयनों में एक ही रंजक है, लेकिन उनकी कुल सांद्रता और लवण की पृष्ठभूमि अलग-अलग हैं। उनके योजनाबद्ध स्पेक्ट्रम दिखाते हैं कि स्टैकिंग बढ़ने पर अधिक तरंगदैर्घ्य वाले एकलक बैंड का हिस्सा घटता है और कम तरंगदैर्घ्य वाले द्विलक बैंड का हिस्सा बढ़ता है। चित्र पर परिस्थितियाँ दी गई हैं, क्योंकि उनके बिना इन वक्रों का दोबारा इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। बताई गई परिस्थितियों में मापी गई बैंड स्थितियों के लिए स्पेक्ट्रमी संदर्भ इस्तेमाल करें। विलयन में आने के बाद रंजक कोशिकाओं में कैसे प्रवेश करता है, इसके लिए अपचयन और विभाजन के माध्यम से कोशिका में प्रवेश देखें। प्रकाश की मात्रा और ज्यामिति प्रकाश-रासायनिक मापों को आगे कैसे प्रभावित करती हैं, इसके लिए प्रकाश अनावरण और मापन की ज्यामिति देखें।

याद रखने वाले नियम के दो हिस्से हैं। स्पेक्ट्रम बताई गई परिस्थितियों में क्यूवेट में मौजूद मिश्रण की पहचान करता है। केवल उन्हीं परिस्थितियों में बनाया गया अंशांकन ही अवशोषकता को कुल सांद्रता में बदल सकता है।