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मेथिलीन ब्लू और फेरोप्टोसिस: लोहा, लिपिड पेरॉक्सिडेशन और कोशिका मृत्यु
फेरोप्टोसिस झिल्ली की क्षति से होने वाली कोशिका मृत्यु है। झिल्लियों में मौजूद बहुअसंतृप्त वसा एक शृंखला अभिक्रिया में ऑक्सीकृत होती है, झिल्ली अपना काम करना बंद कर देती है और कोशिका मर जाती है। इस रासायनिक प्रक्रिया के लिए लोहा आवश्यक है। यही वाक्य पूरी अवधारणा को समेटता है और इस लेख में हर प्रयोग उसके किसी एक हिस्से की जाँच करता है।
यहाँ सवाल अधिक सीमित है: कोशिकीय प्रयोगों में मेथिलीन ब्लू इस क्रम पर क्या असर डालता है और उसका परिणाम वास्तव में क्या दिखाता है। संक्षिप्त उत्तर यह है कि दो प्रयोगशाला अध्ययनों में नैनोमोलर सांद्रता वाले मेथिलीन ब्लू ने माइटोकॉन्ड्रिया में लिपिड पेरॉक्सिडेशन घटाया और ऐसे प्रेरकों के संपर्क के बाद कोशिकाओं को जीवित रखा, जो अन्यथा फेरोप्टोसिस पैदा करते हैं। विस्तृत उत्तर अधिक महत्त्वपूर्ण है, क्योंकि इस क्रम की हर कड़ी को अलग हस्तक्षेप से परखा गया था और हर हस्तक्षेप की अपनी सीमाएँ हैं।
एक अनुच्छेद में फेरोप्टोसिस
बहुअसंतृप्त वसीय अम्ल की पूँछ वाले झिल्ली फॉस्फोलिपिड में एक कमजोर बिंदु होता है: हाइड्रोजन परमाणु जिन्हें आसानी से छीना जा सकता है। जब कोई मुक्त मूलक एक हाइड्रोजन परमाणु छीन लेता है, तो ऑक्सीजन लिपिड से जुड़ती है, एक लिपिड पेरॉक्सिल मूलक बनता है और वह मूलक अगले लिपिड से हाइड्रोजन छीनता है। जब तक कोई चीज इसे रोक न दे, अभिक्रिया झिल्ली के साथ आगे बढ़ती रहती है।
इसे रोकने वाला मुख्य घटक GPX4 नाम का एंजाइम है, जो ग्लूटाथियोन की मदद से लिपिड पेरॉक्साइडों को अपचयित करके हानिरहित लिपिड अल्कोहल में बदलता है। प्रयोगशाला में इस्तेमाल होने वाले प्रेरक इस सुरक्षा व्यवस्था पर विशिष्ट बिंदुओं पर प्रहार करते हैं। एरास्टिन, सिस्टम xc-माइनस के माध्यम से सिस्टीन के ऑक्सीकृत द्विमेर, सिस्टिन, के प्रवेश को रोकता है। इससे कोशिका में ग्लूटाथियोन संश्लेषण के लिए आवश्यक सिस्टीन की कमी हो जाती है। ब्यूथियोनीन सल्फॉक्सिमीन सीधे ग्लूटाथियोन संश्लेषण को रोकता है। RSL3 स्वयं GPX4 को अवरुद्ध करता है। तीनों के कारण पेरॉक्साइड हट नहीं पाते, लेकिन वे अलग-अलग चरणों पर काम करते हैं। इसलिए एक प्रेरक के साथ मिला परिणाम अपने आप अन्य प्रेरकों पर लागू नहीं होता।
फेरोप्टोसिस को परिभाषित करने वाली विशेषताएँ उसे एपोप्टोसिस से अलग करती हैं। इसमें न कैस्पेस सक्रियण का क्रम होता है, न एपोप्टोटिक पिंड बनते हैं। डेफेरॉक्सामीन जैसे लौह केलेटर और फेरोस्टैटिन-1 जैसे मुक्त मूलकों को निष्क्रिय करने वाले एजेंट इसे दबाते हैं। शोधकर्ता इसी व्यावहारिक परीक्षण के आधार पर किसी कोशिका मृत्यु को केवल नेक्रोसिस के बजाय फेरोप्टोसिस कहते हैं। विनियमित कोशिका मृत्यु के विभिन्न मार्गों का व्यापक संदर्भ इस अंतर को समझने में मदद करता है। कोशिकाएँ आसानी से अभिक्रिया करने वाले लोहे को कैसे संभालती हैं, यह समझने से स्पष्ट होता है कि केलेशन इतना निर्णायक नियंत्रण परीक्षण क्यों है।
माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका कहाँ है और इस पर विवाद क्यों हुआ
शुरुआती शोध में बताया गया था कि माइटोकॉन्ड्रियल DNA के बिना भी कोशिकाओं में फेरोप्टोसिस होता है। इससे संकेत मिला कि माइटोकॉन्ड्रिया आवश्यक नहीं हैं। बाद के शोध में पाया गया कि माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या घटाने या कोशिकीय श्वसन को रोकने से सिस्टीन की कमी के कारण होने वाला फेरोप्टोसिस दब सकता है, लेकिन GPX4 के सीधे अवरोधन से होने वाला फेरोप्टोसिस नहीं। दोनों परिणाम सही हो सकते हैं, यदि माइटोकॉन्ड्रिया का योगदान प्रेरक, कोशिका के प्रकार और निर्णायक पेरॉक्सिडेशन के स्थान पर निर्भर करता हो।
जिस अध्ययन पर यह लेख आधारित है, उसने कोशिका के एक विशिष्ट हिस्से को लक्षित करने वाले प्रोब से इस विवाद की जाँच की। MitoCLox लिपिड पेरॉक्सिडेशन दर्शाने वाले रिपोर्टर का माइटोकॉन्ड्रिया को लक्षित करने वाला संस्करण है: माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर लिपिड पेरॉक्सिल मूलकों के संपर्क में आने पर उसकी प्रतिदीप्ति बदल जाती है। एरास्टिन से उपचारित फाइब्रोब्लास्ट में माइटोकॉन्ड्रियल प्रोब का ऑक्सीकरण कोशिका मृत्यु से पहले, जीवित कोशिकाओं में ही दिखाई दिया और सभी कोशिकाओं में एक जैसा नहीं था। यह समयक्रम महत्त्वपूर्ण है। मृत्यु से पहले होने वाला पेरॉक्सिडेशन उसका संभावित कारण हो सकता है। केवल मृत कोशिकाओं में मापा गया पेरॉक्सिडेशन मलबे का संकेत है। लिपिड पेरॉक्सिडेशन परीक्षणों और प्रत्येक प्रोब से मिलने वाली जानकारी पर एक सहायक मार्गदर्शिका बताती है कि प्रोब का स्थान किसी संकेत का अर्थ क्यों तय करता है।
यही क्रम एक दूसरे मॉडल में भी दिखाई दिया। लेबर वंशानुगत ऑप्टिक न्यूरोपैथी वाले एक रोगी के फाइब्रोब्लास्ट, जिनमें कॉम्प्लेक्स I का उत्परिवर्तन और आधारभूत स्तर पर अधिक ऑक्सीडेटिव तनाव था, ग्लूटाथियोन की कमी होने पर फेरोप्टोसिस से मर गए, जबकि नियंत्रण फाइब्रोब्लास्ट इससे बचे रहे। यहाँ भी माइटोकॉन्ड्रियल प्रोब का ऑक्सीकरण पहले हुआ। विवरण फेरोप्टोसिस में माइटोकॉन्ड्रियल लिपिड पेरॉक्सिडेशन के फाइब्रोब्लास्ट अध्ययन में दिए गए हैं।
इन प्रयोगों में मेथिलीन ब्लू ने क्या बदला
मेथिलीन ब्लू एक रेडॉक्स वाहक है। उसका ऑक्सीकृत रूप कॉम्प्लेक्स I पर NADH से जुड़ी रासायनिक प्रक्रिया से इलेक्ट्रॉन स्वीकार करता है और उसका अपचयित रूप उन्हें साइटोक्रोम c को देता है, जो कॉम्प्लेक्स IV तक इलेक्ट्रॉन पहुँचाता है। इससे शृंखला के उस हिस्से को आंशिक रूप से दरकिनार करने वाला मार्ग बनता है, जहाँ सामान्यतः इलेक्ट्रॉन ऑक्सीजन को रिसकर सुपरऑक्साइड बनाते हैं। इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण का पूरा क्रम समझने के लिए पाठक मेथिलीन ब्लू माइटोकॉन्ड्रिया में इलेक्ट्रॉनों को कैसे स्थानांतरित करता है से शुरुआत कर सकते हैं।
एरास्टिन से उपचारित फेफड़ों के फाइब्रोब्लास्ट में 250 नैनोमोलर सांद्रता वाले मेथिलीन ब्लू ने कोशिका उत्तरजीविता परीक्षण में जीवनक्षमता बनाए रखी। माइटोकॉन्ड्रिया को लक्षित करने वाले एंटीऑक्सीडेंट SkQ1 और MitoTEMPO ने भी ऐसा किया। नियंत्रण परीक्षण तय करते हैं कि परिणाम के आधार पर क्या दावा किया जा सकता है। फेरोस्टैटिन-1, अल्फा-टोकोफेरॉल और डेफेरॉक्सामीन ने भी सुरक्षा दी, जिससे पुष्टि होती है कि मृत्यु फेरोप्टोसिस से हुई थी। एंटीऑक्सीडेंट समूह के बिना SkQ1 के संरचनात्मक समरूप ने सुरक्षा नहीं दी। यह संकेत देता है कि प्रभाव किसी गैर-विशिष्ट संचय के बजाय रेडॉक्स रसायन से जुड़ा था। SkQ1 की सांद्रता लगभग 200 नैनोमोलर से अधिक होने पर सुरक्षा घट गई। यह अधिक सांद्रता पर क्विनोन एंटीऑक्सीडेंट के ज्ञात ऑक्सीकरण को बढ़ावा देने वाले व्यवहार के अनुरूप है। मेथिलीन ब्लू का व्यवहार भी सांद्रता के अनुसार इसी तरह बदलता है: इन प्रयोगशाला पात्रों में कम नैनोमोलर स्तर पर वह सुरक्षात्मक था, जबकि अधिक सांद्रता या तेज प्रकाश में रेडॉक्स चक्रण के जरिए हाइड्रोजन पेरॉक्साइड उत्पन्न कर सकता है। सांद्रता से जुड़े इस संदर्भ की चर्चा माइटोकॉन्ड्रिया में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों में की गई है।
इसके बाद पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के प्रयोगों ने ROS के स्रोतों को अलग-अलग परखा। फेरस लौह की मौजूदगी में कॉम्प्लेक्स I को इलेक्ट्रॉन देने वाले सब्सट्रेटों के साथ रोटेनोन ने प्रोब के ऑक्सीकरण को बढ़ाया। रोटेनोन फ्लेविन स्थल के बाद वाले हिस्से को अवरुद्ध करता है। इसलिए उससे पहले के वाहक अपचयित बने रहते हैं और मैट्रिक्स की ओर स्थित फ्लेविन से इलेक्ट्रॉन ऑक्सीजन को रिसते हैं। कॉम्प्लेक्स III को इलेक्ट्रॉन देने वाले सब्सट्रेटों के साथ एंटीमाइसिन A ने बड़ी मात्रा में हाइड्रोजन पेरॉक्साइड उत्पन्न किया, फिर भी लिपिड पेरॉक्सिडेशन नहीं बढ़ाया। कुल ROS का संकेत समान था, लेकिन स्थान अलग था और परिणाम भी अलग था। SkQ1 और मेथिलीन ब्लू, दोनों ने हाइड्रोजन पेरॉक्साइड के उत्पादन को दबाए बिना कॉम्प्लेक्स I से प्रेरित पेरॉक्सिडेशन को दबाया। इससे उनकी क्रिया ROS बनने के बाद, लिपिड पेरॉक्सिडेशन के चरण पर स्थित होती है।
लौह अधिभार वाला अध्ययन और लिपोफुसिन से मिला संकेत
दूसरे अध्ययन ने लोहे की भूमिका के दृष्टिकोण से इस प्रश्न को परखा। सबमिलीमोलर सांद्रता वाले फेरिक अमोनियम साइट्रेट के संपर्क में आए H9c2 हृदय पेशी कोशिकाओं में पहले माइटोकॉन्ड्रियल ROS, फिर माइटोकॉन्ड्रियल लिपिड पेरॉक्सिडेशन और उसके बाद फेरोप्टोसिस हुआ। इसके बाद 24 घंटे के भीतर लिपोफुसिन जैसा वर्णक जमा हुआ। लिपोफुसिन ऑक्सीकृत लिपिडों और प्रोटीनों का स्वतः प्रतिदीप्त, लौह-युक्त अवशेष है, जो उम्र बढ़ने के साथ जमा होता है। यहाँ उसका तेजी से बनना लोहे से प्रेरित तीव्र पेरॉक्सिडेशन को उम्र बढ़ने के एक परिचित चिह्नक से जोड़ता है। नैनोमोलर सांद्रता वाले मेथिलीन ब्लू और SkQ1, दोनों ने पेरॉक्सिडेशन, मृत्यु और वर्णक के संचय को रोका। पृथक हृदय माइटोकॉन्ड्रिया ने इस क्रम की पुष्टि की: फेरस लौह के साथ रोटेनोन ने पेरॉक्सिडेशन और वर्णक जैसा संकेत उत्पन्न किया और दोनों एजेंटों ने इसे रोका। पूरा क्रम H9c2 हृदय पेशी कोशिकाओं में लौह अधिभार के अध्ययन में बताया गया है। वर्णक से जुड़े इस पहलू को लिपोफुसिन और कोशिकीय उम्र बढ़ने के चिह्नकों के साथ समझा जा सकता है।
कोशिका उत्तरजीविता परीक्षण क्या नहीं दिखाते
CellTiterBlue जैसा जीवनक्षमता परीक्षण बताता है कि किसी प्रेरक और संभावित सुरक्षात्मक एजेंट के संपर्क के बाद प्रयोगशाला पात्र में कितनी कोशिकाएँ चयापचय की दृष्टि से सक्रिय रहती हैं। यह एक परिभाषित तंत्र में किसी क्रियाविधि का परीक्षण है। यह उपचार का परिणाम नहीं है। इनमें से किसी भी प्रयोग में किसी रोगी को खुराक नहीं दी गई, रोग से संबंधित कोई परिणाम नहीं मापा गया और शरीर में प्रभावी तथा सुरक्षित खुराक की सीमा स्थापित नहीं की गई।
चार सीमाएँ स्पष्ट रूप से बताना आवश्यक है। पहली, कोशिका प्रकार सीमित हैं: रूपांतरित फेफड़ों के फाइब्रोब्लास्ट, प्राथमिक त्वचा फाइब्रोब्लास्ट जिनमें माइटोकॉन्ड्रियल रोग वाली एक कोशिका वंशरेखा शामिल थी, चूहे की हृदय पेशी कोशिका वंशरेखा और चूहे के हृदय से पृथक माइटोकॉन्ड्रिया। संवेदनशीलता वंशरेखा के अनुसार अलग थी और LHON वंशरेखा को अध्ययन में उसकी असामान्य संवेदनशीलता के कारण चुना गया था। दूसरी, प्रेरक प्रयोगशाला की अत्यधिक स्थितियाँ थे: परिवहन या संश्लेषण का पूर्ण अवरोध और इतना अधिक लौह भार, जिसका किसी ऊतक को अचानक सामना नहीं करना पड़ेगा। तीसरी, सांद्रता को केवल गुणा करके मानव खुराक में नहीं बदला जा सकता। संवर्धन माध्यम में नैनोमोलर सांद्रता मानव खुराक नहीं है। प्रयोगशाला पात्र और व्यक्ति के बीच मेथिलीन ब्लू का वितरण, रक्त और ऊतकों में उसका अपचय होकर रंगहीन रूप में बदलना, प्रकाश का संपर्क और झिल्ली विभव जैसे कारक आते हैं। चौथी, प्रोब अपने ही कोशिकीय हिस्से की जानकारी देते हैं। MitoCLox का ऑक्सीकरण दिखाता है कि माइटोकॉन्ड्रिया में लिपिड मूलक बने। यह नहीं दिखाता कि प्लाज़्मा झिल्ली का फटना, जो संभवतः अंतिम घटना है, सीधे रोका गया था या पहले के चरण में हस्तक्षेप के कारण उससे बचा गया था।
इसलिए साक्ष्य के अनुरूप दावा यह है: इन मॉडलों में कॉम्प्लेक्स I से उत्पन्न ROS और लोहा मिलकर माइटोकॉन्ड्रियल लिपिड पेरॉक्सिडेशन को बढ़ाते हैं, जो फेरोप्टोसिस से पहले होता है, और कम सांद्रता वाला मेथिलीन ब्लू इस हिस्से को बाधित करता है। इस हिस्से से आगे किसी भी निष्कर्ष के लिए पहले पशुओं में और फिर मनुष्यों में अलग प्रयोग आवश्यक हैं।