פענוח המראה של מושבות E. coli ומושבות אחרות על אגר EMB

סטודנט זורע דגימה לא מזוהה בשיטת בידוד על אגר אאוזין־מתילן כחול, מדגיר אותה למשך הלילה וחוזר לצלחת ובה מושבות כהות עם נצנוץ ירוק. ברישום במחברת נכתב: "E. coli, מאומת". הרישום הזה טוען יותר מכפי שהצלחת יכולה לבסס. הצלחת מציגה פנוטיפ של צמיחה ותסיסה בתנאים מסוימים. זיהוי המין הוא טענה נפרדת, שדורשת ראיות נפרדות.

מדריך זה מתייחס לתוצאות אגר EMB כאל משימת פענוח. הוא מסביר את העיקרון שבבסיס המצע, מציג אטלס צלחות מאויר עם בקרות ומפרט מקרים שבהם התמונה המוכרת מספרי הלימוד עלולה להטעות.

העיקרון שמאחורי הצלחת

אגר EMB הוא מצע בררני ומבדיל גם יחד. הצבעים אאוזין Y ומתילן כחול מעכבים אורגניזמים גראם־חיוביים רבים, ולכן המצע מעדיף צמיחה של גראם־שליליים. אותם צבעים משמשים גם כאינדיקטורים: כאשר אורגניזם מתסיס את הסוכר הזמין ומייצר מספיק חומצה מקומית, המושבה קולטת כמות רבה של צבע והופכת לסגולה כהה עד כחולה־שחורה. כשייצור החומצה נמרץ, פני המושבה עשויים להציג ברק ירוק מתכתי המשתנה עם זווית הצפייה. פרוטוקול ASM לצלחות אגר אאוזין־מתילן כחול מתאר את השילוב הזה של בררנות והבחנה ומספק תצלומי ייחוס להוראה.

לפני פענוח כל תוצאה חשוב לבדוק פרט אחד: באיזו פורמולציה משתמשים. פורמולציית Holt Harris Teague הוותיקה מכילה לקטוז וסוכרוז, ואילו Levine EMB מכילה לקטוז בלבד. אורגניזם שמתסיס סוכרוז אך לא לקטוז, כגון מבודדים רבים של Serratia marcescens, עשוי להיראות אחרת בשתי הגרסאות. תיעוד היצרן למצעי EMB מציין במפורש את ההבדל הזה בפורמולציה. יש לרשום במחברת את היצרן ואת הפורמולציה לצד התוצאה.

אגר EMB מוכן שלא נזרע הוא בדרך כלל אדום־חום עד סגול־אדמדם, ולעיתים יש לו גוון ירקרק או משקע דק. צבע הרקע הזה אינו צמיחה. יש להשוות כל קריאה לצלחת שלא נזרעה או למראה הבסיס המתועד, ולקרוא את הצלחת הראשונית לאחר כ־18 עד 24 שעות של הדגרה אירובית ב־35 עד 37 C, אלא אם פרוטוקול ההוראה מציין אחרת. הדגרה ממושכת עשויה לשנות את מראה התסיסה.

כיצד לבחון את הצלחת

השתמשו בשני סוגי תאורה. תחילה בחנו את הצלחת באור מוחזר או אלכסוני והטו אותה: הברק המתכתי משתנה עם זווית הצפייה ועשוי להופיע או להיעלם בהתאם לה. לאחר מכן בחנו אותה באור העובר דרך הצלחת כדי להעריך את צבע המושבות ואת המרכזים הכהים. עבדו עם מושבות מבודדות היטב, משום שצפיפות ומושבות שכנות משנות את הצטברות החומצה המקומית ועלולות להחליש את הצבע או להעצים אותו. אוסף התמונות של ASM מדגים זאת ישירות: E. coli בתרבית מעורבת עלול לאבד את הברק הצפוי, משום שאורגניזמים סמוכים משנים את הסביבה החומצית.

כללו בקרות בכל פעם שהתרגיל מאפשר זאת. מערך נפוץ בהוראה כולל E. coli ATCC 25922 לבקרת הפנוטיפ הכחול־שחור והברק המתכתי, חיידק שאינו מתסיס כגון Salmonella Typhimurium ATCC 14028 או Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 לבקרת הפנוטיפ חסר הצבע, וחיידק גראם־חיובי כגון Enterococcus faecalis או Staphylococcus aureus כבקרת עיכוב, כפי שמפורט בטבלאות בקרת האיכות המקובלות למצעי EMB. אם בבקרה החיובית אין ברק, חשדו תחילה בתנאי ההדגרה, בצפיפות או בפורמולציה, לפני שתחשדו בדגימה הלא מזוהה.

אטלס צלחות מאויר

הצלחות שלהלן הן איורים שנוצרו לצורך המחשה, ולא תצלומים של תרביות אמיתיות. הן מציגות את הדפוס שיש לחפש, ולא את הגוון המדויק של זן מסוים. השוו אותן לתצלומי הייחוס של ASM ולצלחות אמיתיות ממעבדת ההוראה.

צלחת 1: Escherichia coli על אגר EMB, מתסיס לקטוז נמרץ

E. coli על אגר EMB נראה בדרך כלל סגול כהה עד כחול־שחור, לעיתים קרובות עם מרכז כהה וברק ירוק מתכתי הנובע מייצור חומצה נמרץ. הברק הוא הממצא המפורסם שסטודנטים מחפשים, אך יש להתייחס אליו כראיה תומכת ולא כהגדרה. עוצמת הברק משתנה בהתאם לזן, לזמן ההדגרה, לצפיפות המושבות ולזווית הצפייה. היעדר ברק אינו שולל E. coli, ומושבה כהה ללא ברק יכולה להתאים לכמה חיידקים מתסיסים אחרים. לכל עבודת המשך יש לבחור מושבה מבודדת היטב, ולא להסתמך על קריאה מאזור צפוף.

צלחת 2: Klebsiella pneumoniae על אגר EMB, מתסיס בעל מראה רירי

Klebsiella pneumoniae על אגר EMB יוצר בדרך כלל מושבות גדולות, מבריקות וריריות בגוונים של ורוד־סגול עד חום־סגול, לעיתים קרובות עם מרכזים כהים אך בדרך כלל ללא ברק מתכתי חזק. מורפולוגיה דומה מופיעה אצל חיידקים מתסיסים קרובים, כגון Enterobacter. המרקם הרירי וגודל המושבה הם חלק מהפענוח: למושבה ורודה קטנה ושטוחה יש משקל שונה מזה של מושבה רירית גדולה וקמורה. כמו במקרה של E. coli, הצלחת מצביעה על פנוטיפ תסיסה, וקביעת שם ברמת המין דורשת את האימות הביוכימי המתואר בהמשך.

צלחת 3: Salmonella על אגר EMB וחיידקים אחרים שאינם מתסיסים, מושבות חסרות צבע

Salmonella על אגר EMB וחיידקים קרובים אחרים שאינם מתסיסים לקטוז, ובהם Shigella ומבודדים רבים של Pseudomonas, גדלים בדרך כלל כמושבות חסרות צבע, שקופות למחצה או בגוון ענברי בהיר. פורמולציות ותנאים מסוימים מעניקים גוון ורדרד חלש, ולכן מושבה ורודה בהירה אינה מעידה אוטומטית על חיידק מתסיס. EMB אינו מבחין בין Salmonella לבין Shigella או חיידקים אחרים שאינם מתסיסים; ההבחנה הזאת נעשית בבדיקות בהמשך. שימו לב גם שתועדו זני Salmonella המתסיסים לקטוז ומייצרים מושבות מתכתיות דמויות E. coli, וזו סיבה נוספת לכך שצלחת אחת אינה מספיקה להכרעה.

צלחת 4: Serratia marcescens ומלכודת הפורמולציה

Serratia marcescens מקבל סעיף משלו משום שסטודנטים מצפים לעיתים קרובות למושבות אדומות, ובעקבות זאת מפענחים את הצלחת באופן שגוי. רוב המבודדים הקליניים אינם מתסיסים לקטוז, ולכן על Levine EMB הם נראים לרוב בהירים עד בעלי צבע חלש. מכיוון שמבודדים רבים מתסיסים סוכרוז, פורמולציה המכילה סוכרוז עשויה להפיק תגובה כהה יותר או תגובה המעידה יותר על חומציות. גם ב־35 עד 37 C אין לצפות לפיגמנט הפרודיגיוזין האדום האופייני; ייצור הפיגמנט אינו עקבי בטמפרטורת האינקובטור. כאשר הפרוטוקול מתייחס ל־Serratia marcescens על אגר EMB, בדקו איזו פורמולציה עומדת בבסיס התיאור. סקירה של חילוף החומרים של Serratia מסכמת את הדפוס של אי־תסיסת לקטוז ותסיסת סוכרוז משתנה, העומד מאחורי המלכודת הזאת.

צלחת 5: בקרות ואורגניזמים שצמיחתם מעוכבת

אורגניזמים גראם־חיוביים כגון Staphylococcus, ‏Enterococcus, ‏Streptococcus ו־Bacillus מעוכבים בדרך כלל או שצמיחתם מדוכאת במידה ניכרת על אגר EMB, אף שהעיכוב אינו מוחלט בכל זן. מערך בקרות מאפשר פענוח מהימן: בקרת E. coli אמורה להראות צמיחה טובה עם צבע כחול־שחור וברק, בקרת החיידק שאינו מתסיס אמורה להראות צמיחה חסרת צבע, ובקרת העיכוב אמורה להראות מעט צמיחה או לא להראות צמיחה כלל. אם בקרת העיכוב צומחת היטב, שלב הברירה נכשל וכל קריאה אחרת באותה אצווה מוטלת בספק. שיטות צביעה עונות על שאלה שונה מזו שעונים עליה מצעי תרבית; להיבט של צביעת זכוכיות נושא במעבדה, ראו את אטלס הצביעה במתילן כחול.

השוואה בגבולות הפרשנות

שלושה משפטים מסכמים את המראות המטעים. צבע כהה אינו שקול ל־E. coli, משום ש־Klebsiella, ‏Enterobacter וחיידקים מתסיסים אחרים מפתחים מרכזים כהים ללא ברק. צבע ורוד אינו שקול ל־Klebsiella, משום שחיידקים המתסיסים בקצב בינוני או איטי, וגם כמה חיידקים המוגדרים בדרך כלל כלא־מתסיסים, נראים ורודים או בגוון לבנדר. ברק אינו שקול לזיהוי ודאי של E. coli, משום שגם חיידקים מתסיסים נמרצים אחרים יכולים לייצר אותו. פרוטוקול ההוראה והאיורים של התרביות המעורבות שבו ממחישים כל אחת מהטעויות האלה.

מגבלות האימות

אגר EMB מציג פנוטיפ, לא מין. אורגניזמים שונים יכולים להציג אותו מראה מושבה, ואותו אורגניזם יכול לסטות מהמראה המתואר בספרי הלימוד בהתאם לזן, לגיל, לצפיפות, לפורמולציה ולתנאי ההדגרה. לכן תהליכי עבודה בהוראה ובמעבדות קליניות מתייחסים למורפולוגיה על EMB כאל בסיס לזיהוי משוער.

תהליך עבודה לסטודנטים שניתן להצדיק מקצועית הוא: לתאר את המושבה המבודדת — גודל, צבע, מרכז, ברק באור אלכסוני ואופי רירי — ולתעד את הפורמולציה, זמן ההדגרה, הטמפרטורה והבקרות; לאחר מכן להעביר מושבה מבודדת היטב לתרבית משנה לקבלת תרבית טהורה, לפני כל בדיקת אימות. בדיקות המשך נפוצות כוללות צביעת גראם ותגובות IMViC לזיהוי משוער של E. coli וקוליפורמים, TSI או KIA ומערכי בדיקות ביוכימיות ייעודיים לאורגניזם עבור חיידקי מעיים, לצד זיהוי סרולוגי, MALDI TOF או שיטות זיהוי מתוקפות אחרות כאשר המשימה דורשת זאת. לרקע על מקומו של EMB בין מצעי תרבית בררניים ומבדילים לחיידקי מעיים, ראו מבואות למצעי תרבית לחיידקי מעיים ואת המשך הבדיקה באמצעות צביעת גראם. לשאלה הקשורה, מה צביעה כחולה של זכוכית נושא יכולה ואינה יכולה להוכיח, אטלס הצביעה במתילן כחול מפריד באותה רוח בין תצפית למסקנה.

כתבו את התצפית לפני המסקנה. "מושבות כחולות־שחורות כהות עם ברק ירוק התלוי בזווית הצפייה על Levine EMB לאחר 24 שעות, ממצא התואם תסיסה נמרצת של לקטוז" הוא ניסוח שניתן להצדיק. "E. coli, מאומת" דורש את שלב האימות שהצלחת לבדה אינה יכולה לספק.