בדיקות שמרים במתילן כחול: ספירת תאים חיים לעומת תזמון הנשימה

שתי מבחנות ניצבות על שולחן המעבדה. שתיהן כחולות. באחת, תאים כחולים במיקרוסקופ פירושם שמרים מתים. באחרת, מבחנה שהופכת מכחולה לחסרת צבע פירושה שהשמרים חיים ונושמים. אותו צבע, פירושים הפוכים. אם מבלבלים בין שתי הבדיקות, כל המסקנות מתהפכות.

ההבחנה הזאת היא עיקר המאמר. מתילן כחול הוא צבע חמצון־חיזור: בצורתו המחומצנת הוא כחול, ובצורתו המחוזרת הוא לויקומתילן כחול חסר צבע. ספירת תאים חיים מנצלת את הכימיה הזאת בתמונת מצב מיקרוסקופית קצרה. ניסוי נשימה מנצל אותה בתגובה מתוזמנת בתמיסה כולה. לכל בדיקה דרושים פרוטוקול משלה, בקרות משלה וביקורתיות משלה.

ספירת התאים החיים: צביעה קצרה וקריאה ללא דיחוי

הפרוטוקול הנהוג במבשלות בירה הוא הגרסה המתוקננת ביותר. הכינו מתילן כחול בריכוז 0.01% w/v בנתרן ציטראט בריכוז 2%, ערבבו אותו ביחס 1:1 עם תרחיף השמרים, ובחנו את התערובת לאחר פרק זמן קצר וקבוע. פרקי הזמן שפורסמו נעים בין 1 ל־2 דקות במדריך של מכון מדעי הבירה לכ־5 דקות בפרוטוקולים מחקריים, ואילו שיטת OIV למיקרוביולוגיה של יין מחייבת בחינה בתוך 10 דקות. ריכוז הצבע בתערובת הספירה מגיע לכ־0.005%. מלאו תא ספירה משופר מסוג נויבאואר, ובהגדלה של כ־400x סווגו תאים כחולים כהים כתאים שאינם חיים ותאים שלא נצבעו כתאים חיים. בשיטת OIV תאים תכולים מסווגים כחיים, מה שכבר מרמז על בעיית הסובייקטיביות שתידון בהמשך.

ריכוז התאים נגזר מהגאומטריה של תא הספירה. כאשר סופרים את כל הריבוע המרכזי שצלעו 1 mm, מספר התאים לכל mL שווה ל־N כפול מקדם הדילול כפול 10^4, כאשר N הוא מספר התאים שנספרו בשטח זה, כפי שמפורט בשיטות ASBC לבדיקת שמרים. חישוב שיעור התאים החיים פשוט יותר: מספר התאים שלא נצבעו חלקי מספר התאים הכולל, כפול 100. ספרו כ־400 תאים כדי לאמוד את שיעור התאים החיים, בהתאם למחקר ההשוואתי במבשלות שפורסם ב־FEMS ולנוהג של OIV. הקפידו על כלל גבולות אחיד, למשל הכללת תאים שעל קווי הרשת התחתונים והשמאליים והחרגת תאים שעל הקווים העליונים והימניים.

יש לקבוע כלל לספירת ניצנים לפני תחילת הספירה. לפי מוסכמה נפוצה, ניצן נספר כתא נפרד כאשר הוא מגיע לכמחצית מגודלו של תא האם; מתחת לגודל זה הוא נספר יחד עם תא האם. יהיה הכלל שנבחר אשר יהיה, יישמו אותו בכל ריבוע ורשמו אותו בדף הספירה כדי שהאדם הבא יוכל לחזור עליו.

דף ספירה (להדפסה)

דף זה הוא חומר מקורי שנוצר עבור המאמר. העתיקו אותו למחברת או הדפיסו עותק לכל דגימה.

שיעור התאים החיים (%) = 100 x תאים שלא נצבעו / (תאים שלא נצבעו + תאים כחולים כהים). סך התאים לכל mL = N x מקדם הדילול x 10^4, כאשר N הוא הספירה בשטח המוגדר של תא הספירה. רשמו את משך הצביעה לצד התוצאה, מפני שאי אפשר לשחזר נתון על שיעור התאים החיים ללא ציון התזמון שלו.

מדוע אומדני שיעור התאים החיים משתנים

התזמון הוא ההפרעה הראשונה, והשפעתו פועלת בשני הכיוונים. תאים פעילים מבחינה מטבולית מחזרים את הצבע, ולכן קריאה מוקדמת עלולה לתפוס תאים חיים לפני שסיימו לחזר אותו ולסווג אותם בטעות כמתים. אך חשיפה ממושכת היא עצמה רעילה ויוצרת תאים כחולים שנפגעו באמת, וכך מתקבלת צביעה המעידה באופן מטעה על מוות. לכן פרוטוקול הוראה במעבדה מורה לבצע את הסיווג בתוך 5 דקות, כפי שמתועד בפרוטוקול הוראה על שמרים מאוניברסיטת ויסקונסין. הניסוח הזהיר הוא שסיווג באמצעות מתילן כחול תלוי בזמן, ולכן יש לקבוע פרק זמן קצר אחד ולשמור עליו קבוע בכל הדגימות בסדרה.

בדגימות שבהן שיעור התאים החיים נמוך קיימת הטיה נוספת. השיטה המתוקננת מזהירה שמתילן כחול עלול להעריך ביתר את שיעור התאים החיים האמיתי כשהוא נמוך מכ־80%, משום שתאים שעדיין מחזרים צבע אינם בהכרח שומרים על יכולת ההתרבות. גם הספרות בתחום הבירה מתארת את אותה אי־אמינות כאשר שיעור התאים החיים ירוד במידה ניכרת. התייחסו למתילן כחול כאומדן מהיר ומקורב, ואמתו החלטות חשובות המבוססות על שיעור נמוך של תאים חיים, כגון שימוש חוזר בתרבית להתססה, באמצעות ספירת מושבות על מצע או צביעה משלימה.

השפעות מטריצת הדגימה הן הגורם השלישי. שיטת OIV מתבצעת בסביבת pH 4.6 ומזהירה שדגימות בעלות pH נמוך וכושר חציצה גבוה מונעות התנהגות תקינה של הצבע. היא גם ממליצה שלא לבצע את הבדיקה בריכוזי סוכר העולים על 100 g/L, שבהם התאים נראים תכולים באופן מטעה. השוואה ניסויית של ערכי pH בצביעה מצאה שינויים ניכרים ברגישות לאורך הטווח שנבדק, בהתאם למחקר על שיטת מתילן כחול התלויה ב־pH. פסולת היא מלכודת נפרדת: חלקיקים צבועים במאש לא נקי דומים לתאים מתים ומגדילים את השונות בין מפעילים.

השונות הזאת נמדדה, ואינה בגדר התרשמות בלבד. בניסוי בן שישה חודשים במבשלת בירה, שדווח בהשוואת שיטות בדיקת השמרים של FEMS, מדידות כפולות במתילן כחול הראו סטיית תקן ממוצעת של 6.1%, לעומת 0.2% בציטומטריית זרימה עם אוקסונול, וההפרש בין שני מפעילים הגיע עד 13 נקודות אחוז באותה דגימה. השוואה כמותית של שיטות לבדיקת חיות משנת 2023 מצאה שמיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה מדויקות במידה ניכרת, והראתה גם שהביצועים תלויים במין ובמטריצת הדגימה. התיאור הקלאסי של השיטה מאת פיינטינג וקירסופ (PMID 24430080) נותר נקודת הייחוס, וסקירה רחבה יותר של בדיקות חיות ופעילות מטבולית בשמרים (PMID 25154541) מציגה את מתילן כחול כאחת הבדיקות המשלימות ולא כבדיקה מכרעת. טריפן כחול אינו שדרוג אוטומטי כאן: הוא מעיד על אובדן שלמות הקרום, ואילו מתילן כחול מעיד על קליטת הצבע ועל פעילות חיזור, ולכן תאים בתנאי עקה עשויים להיות מסווגים אחרת בשני הצבעים.

ניסוי הנשימה: מדידת הזמן עד להיעלמות הכחול

בבדיקה השנייה כלל לא משתמשים במיקרוסקופ. שמרים, גלוקוז ומתילן כחול מדולל מוכנסים למבחנה סגורה, והשעון מודד כמה זמן נדרש לכחול להיעלם. במהלך הפעילות המטבולית, התאים מייצרים שקולי חיזור שממירים את הצבע הכחול לצורתו חסרת הצבע, בעוד חמצן מומס מחמצן אותו בחזרה. כאשר התאים מורידים את רמת החמצן, החיזור גובר במאזן הכולל והמבחנה מאבדת את צבעה. לכן נקודת הסיום משקפת את האיזון בין הנשימה, ריכוז הצבע וזמינות החמצן, ויש לדווח עליה כזמן חיזור או היעלמות צבע של מתילן כחול, ולא כקצב ישיר של צריכת חמצן מולקולרי.

השתמשו בצבע מדולל הרבה יותר מאשר בספירת תאים חיים, כדי שמשך המדידה ייפול בחלון זמן נוח. מדריך ניסויי החובה של AQA לרמת A level מציג תקנון ברור: 1 g גלוקוז לכל 100 mL מים שחוממו לכ־30 C, תוספת של 5 g שמרים יבשים מיד לפני השימוש, ותמיסת עבודה של צבע בריכוז של כ־0.001%, המוכנה מדילול 0.1 mL של תמיסת אם בריכוז 1% לנפח של 100 mL. ערבבו 2 mL של תרחיף שמרים וגלוקוז עם 2 mL של תמיסת העבודה של הצבע, הביאו לשיווי משקל בטמפרטורת הבדיקה, נערו פעם אחת במשך 10 שניות, הפעילו את שעון העצר ואל תנערו שוב. ניעור מחזיר חמצן וצובע את המבחנה שוב בכחול, וזהו הארטיפקט הפרוצדורלי הגדול ביותר. AQA מציינת שהתערובת אמורה בדרך כלל לאבד את צבעה בתוך כ־5 דקות ב־35 C, עם ממוצעי ניסוי של 275 s ב־20 C, ‏128 s ב־35 C ו־145 s ב־45 C. אלה דוגמאות ממערך ניסוי אחד, ולא ערכי ייחוס אוניברסליים. הקשר הכמותי בין קצב החיזור לבין שמרים פעילים מבחינה מטבולית בתנאים מבוקרים נתמך במחקרי חיזור ייעודיים, ובהם העבודה המאונדקסת כ־PMID 25773544 והמחקר המנגנוני בכתב העת Yeast משנת 2014.

הדגמת מהלך בזמן (חומר מקורי)

הטבלה שלהלן היא הדגמה מקורית שנוצרה עבור המאמר באמצעות מערך בסגנון AQA המתואר לעיל: 2 mL של תערובת שמרים וגלוקוז ועוד 2 mL של תמיסת עבודה של הצבע בריכוז של כ־0.001%, ניעור אחד של 10 שניות, ולאחריו הדגרה ללא הפרעה. הרשומות הן קריאות לדוגמה בפורמט שבו קבוצת תלמידים אמורה לתעד את הנתונים, כאשר מדד הקצב מוגדר כ־1 חלקי הזמן עד להיעלמות הצבע בשניות. בצעו את הניסוי באותן מבחנות והחליפו את הרשומות הללו בערכים שנמדדו.

שרטטו את מדד הקצב כתלות בטמפרטורה עבור מבחנות A, B ו־C. העקומה עולה ואז מתמתנת או יורדת, וזהו הדפוס הצפוי בתהליך המונע באנזימים, ולא קו ישר. מבחנות D, E ו־F אינן נקודות נתונים על העקומה הזאת. הן הבקרות שמאפשרות לפרש אותה.

בקרות שמעניקות משמעות לכל בדיקה

כל הרצה של ניסוי נשימה זקוקה לשלוש מבחנות נלוות. שמרים שהורתחו או הומתו, יחד עם גלוקוז וצבע, אמורים להישאר כחולים, ובכך להוכיח שחיזור מהיר תלוי בפעילות מטבולית של תאים חיים. שמרים חיים עם צבע וללא תוספת גלוקוז הם בקרת מצע, אך יש לצפות בכל זאת להיעלמות איטית של הצבע משום שהשמרים מנצלים מאגרים פנימיים. גלוקוז וצבע ללא שמרים הם הבלנק הכימי, והוא חיוני משום שגלוקוז בסביבה בסיסית יכול לחזר מתילן כחול גם ללא נוכחות תאים.

ספירת תאים חיים זקוקה לסוג אחר של בקרה: אחידות פרוצדורלית. אותה תמיסת אם של צבע, אותו יחס ערבוב, אותו משך צביעה, אותו שטח בתא הספירה, אותם כללי ניצנים וגבולות, וספירה בסמיות ככל האפשר. כשיש פער של עשר נקודות אחוז בין שני מפעילים, דף הספירה בדרך כלל חושף את הסיבה: תזמון שונה, סף שונה לסיווג כחול או כללים שונים לספירת ניצנים. שיטות הכנת התאים הצבועים וההתבוננות בהם קשורות לשיטות צביעה פשוטה של חיידקים, ואילו סקירה רחבה יותר של מה שהצבע מסמן בדגימות שונות מופיעה באטלס הצביעה למיקרוסקופיה. להבנת הפיזיקה שמאחורי קריאה כמותית של כל עוצמת כחול, מקור הייחוס לבליעה, שבו מצוינים תנאי המדידה, מסביר מדוע כל מקדם חייב להיות מלווה בתנאי הממס, ה־pH והריכוז שלו.

בחרו את הבדיקה לפי השאלה. כמה תאים חיים ברגע זה היא שאלת ספירה, שעליה עונים באמצעות מיקרוסקופ ודף ספירה. עד כמה התרבית הזאת פעילה בנשימה היא שאלה קינטית, שעליה עונים באמצעות שעון עצר ומבחנות בתנאים מבוקרים. מתילן כחול משמש לשתיהן, אך לעולם לא באותה מבחנה באותו זמן.