מתילן כחול ואיתות דלקתי: אינפלמזומים, IL-6 ו-STAT3

נניח ששלוש מעבדות מדווחות כי אותה תרכובת כחולה היא נוגדת דלקת. אחת מראה הפרשה מופחתת של IL-1beta ממקרופאגים. השנייה מראה פחות אנזים iNOS באותו סוג תא. השלישית מראה פחות IL-6 בדם ופחות פעילות STAT3 במוח. מפתה לאחד את שלושת הממצאים לטענה אחת. האיחוד הזה מטשטש את הממצא.

כל תוצאה שייכת למנגנון איתות אחר, עם גורם מפעיל, שלב הרכבה ומדד משלו. מתילן כחול פועל בכל מנגנון בנקודה אחרת. השאלה אם משהו מכל זה משפר תוצאה בריאותית היא שאלה נפרדת, הנדונה בסקירה שלנו על מתילן כחול ודלקת. עמוד זה מתמקד במסלולים.

מסלול 1: הרכבת אינפלמזום וקספאז-1

אינפלמזום הוא פיגום חלבוני הנבנה לפי הצורך בתוך תא מיאלואידי. מרכיביו הם חיישן, חלבון מתאם הנקרא ASC ואנזים מבצע הנקרא קספאז-1. לאחר ההרכבה, קספאז-1 מבקע את pro-IL-1beta ואת pro-IL-18 לצורותיהם המופרשות, ויכול לעורר פירופטוזיס, צורה דלקתית של מוות תאי. החיישן מגדיר את הסוג: NLRP3 מגיב לגבישים ולרעלנים יוצרי נקבוביות, כגון ניגריצין ו-ATP, ‏NLRC4 מגיב לפלגלין חיידקי, AIM2 מגיב ל-DNA דו-גדילי בציטוזול, והמסלול הלא-קנוני מגיב לליפופוליסכריד תוך-תאי.

ההפעלה דורשת שני אותות. האות הראשון הוא הכנה: ליגנד של קולטן דמוי Toll מניע שעתוק תלוי NF-kB של NLRP3 ושל pro-IL-1beta, כך שהמרכיבים יהיו זמינים. האות השני הוא הרכבה: גורם מפעיל נוסף גורם ל-ASC להתאגד לאוליגומרים היוצרים צברים, לקספאז-1 להתבקע למקטע p20 שלו ול-IL-1beta הבשל, p17, להשתחרר. צורוני חמצן פעילים ממקור מיטוכונדריאלי וקליטת גבישים הם גורמים מוכרים התורמים לאות השני של NLRP3.

המחקר משנת 2017 על עיכוב רחב של אינפלמזומים במקרופאגים בחן מתילן כחול בשני האותות. במקרופאגים ממח העצם של עכברים שעברו הכנה באמצעות ליפופוליסכריד, ניגריצין, ATP וגבישי אוראט חד-נתרי גרמו, כל אחד בנפרד, לשחרור IL-1beta וקספאז-1 וכן להיווצרות צברי ASC. מתילן כחול בריכוז של 20 עד 200 micromolar הפחית את שלושתם באופן תלוי מינון, בלי להרוג את התאים. פלגלין וסלמונלה עבור NLRC4, ‏DNA דו-גדילי וליסטריה עבור AIM2, וליפופוליסכריד שהוחדר בטרנספקציה או חיידקי E. coli חיים עבור המסלול הלא-קנוני הציגו אותה תבנית. התרכובת לבדה לא גרמה לשחרור, ובצלחות הביקורת לא נצפתה השפעה אנטיבקטריאלית, כך שהתוצאה מיוחסת לתגובת המאכסן.

במעלה המסלול נמדדו שלוש השפעות. מתילן כחול הפחית סופראוקסיד מיטוכונדריאלי שהושרה באמצעות רוטנון, ובמקביל פחת גם שחרור IL-1beta שהונע בידי רוטנון. קליטת חרוזים פלואורסצנטיים פחתה, ממצא התואם ירידה בפגוציטוזה לפני חישת הגבישים. גן מדווח שהופעל בידי הפרומוטר של NLRP3, ובו שני אתרי NF-kB, הראה פעילות נמוכה יותר בנוכחות מתילן כחול, בעוד שפרומוטר מקוצר ללא האתרים האלה לא הגיב. במבחנה ללא תאים, מתילן כחול גם הפחית ישירות את פעילותו של קספאז-1 אנושי רקומביננטי. הוספת התרכובת רק בשלב ההכנה או רק בשלב ההפעלה עדיין הפחיתה את שחרור IL-1beta, ‏IL-18 וקספאז-1, כך ששני השלבים מעורבים.

הניסויים בעכברים תאמו את הסלקטיביות הזאת. מינון קטלני של ליפופוליסכריד הרג את עכברי הביקורת בתוך שעות, בעוד שמתילן כחול שיפר את ההישרדות; רמת IL-1beta בנוזל הצפק ירדה, אך רמת IL-6 באותו נוזל לא ירדה. במודל של דלקת צפק עקב ליסטריה, רמת IL-1beta בנוזל הצפק ירדה, בעוד שמספר התאים הכולל נותר ללא שינוי. מונוציטים אנושיים מסוג THP-1 התנהגו כמו מקרופאגים של עכברים בכל ארבעת סוגי האינפלמזומים. ממצא הנוגע לאינפלמזום מסביר את הבשלת IL-1beta ו-IL-18, לא את כלל הציטוקינים. זו גם הסיבה שצורתם של תאי החיסון במוח בניסויים במיקרוגליה ובאסטרוציטים עונה על שאלה שונה מזו של הרכבת הפיגום.

מסלול 2: שעתוק iNOS באמצעות קישור NF-kB ו-STAT1

האנזים המושרה לסינתזת חנקן חד-חמצני, או iNOS, כמעט אינו נוכח במצב מנוחה ומשועתק לפי הצורך. ליפופוליסכריד מניע את שעתוקו בעיקר באמצעות פירוק IkB-alpha, ולאחריו זרחון NF-kB וכניסתו לגרעין. אינטרפרון-גמא מניע את שעתוקו בעיקר באמצעות זרחון STAT1 בידי קינאז יאנוס, ולאחריו כניסת STAT1 לגרעין. כל גורם נקשר אז לאתר שלו בפרומוטר של iNOS. פעילות האנזים והשראת ביטוי הגן הן נקודות בקרה נפרדות, ותרופה יכולה לפעול באחת מהן או בשתיהן.

המחקר משנת 2015 על השראת iNOS במקרופאגים ובעכברים עם אנדוטוקסמיה מיקם את ההשפעה ברמת ה-RNA השליח. בתאי RAW 264.7 ובמקרופאגים ראשוניים של עכברים, מתילן כחול בריכוז של 1 micromolar, שניתן 30 דקות לפני ליפופוליסכריד, אינטרפרון-גמא או שניהם, הפחית את חלבון iNOS ואת ה-mRNA שלו לאורך 8 עד 24 שעות, לצד ירידה בניטריט במצע וללא פגיעה בחיות התאים. בעכברים שקיבלו ליפופוליסכריד במינון של 25 mg per kg, מנה יחידה של 5 mg per kg שניתנה שעה קודם לכן הפחיתה את חלבון iNOS ואת ה-mRNA שלו בריאות, בכבד ובלב.

הפרט המייחד את הממצא הוא מה שלא השתנה. פירוק IkB-alpha, זרחון NF-kB, זרחון STAT1 וההצטברות בגרעין של כל אחד מהגורמים נותרו ללא שינוי. ההפרעה הופיעה שלב אחד מאוחר יותר: תמציות גרעין הראו קישור מופחת של NF-kB לרכיב ה-DNA שלו לאחר חשיפה לליפופוליסכריד, וקישור מופחת של STAT1 לאחר חשיפה לאינטרפרון-גמא. אימונופרסיפיטציה של כרומטין אישרה נוכחות מופחתת של כל אחד מהגורמים בפרומוטר של iNOS בתוך התאים. גם גורם נמק הגידול אלפא, שהפרומוטר שלו משתמש אף הוא ב-NF-kB, פחת. הגורמים הופעלו והגיעו ליעדם, אך נקשרו פחות היטב ל-DNA המטרה שלהם.

שימו לב להבדל לעומת מסלול 1. כאן מדובר בקישור של גורם ל-DNA, מעורב STAT1 ולא STAT3, והמדדים הם mRNA, חלבון וניטריט, ולא צברי ASC ומקטעי קספאז-1. מפת המטרות שלנו למתילן כחול במודלים תאיים מפרידה בין רמת השעתוק הזאת לבין מדידות ישירות של אנזימים ושל פעילות מיטוכונדריאלית.

מסלול 3: IL-6 בסרום והפעלת STAT3 ברקמות

IL-6 מאותת דרך משפחת קולטני gp130 אל שרשרת האיתות מקינאז יאנוס ל-STAT3. ‏STAT3 מזורחן יוצר דימרים, נכנס לגרעין ומניע תוכניות דלקתיות, בעוד ש-IL-6 עצמו הוא מטרה של NF-kB. כך נוצרת לולאת משוב בין השניים, המכונה לעיתים קרובות ציר IL-6–STAT3. המדדים המקובלים הם IL-6 בסרום במעלה המסלול, היחס בין STAT3 מזורחן ל-STAT3 הכולל, ואנזימים מבצעים כגון iNOS ו-COX2 במורד המסלול.

המחקר משנת 2023 בעכברים על IL-6 ו-STAT3 לאחר חשיפה לליפופוליסכריד מדד את הציר במדורים שונים. עכברים זכרים מסוג C57BL/6 קיבלו ליפופוליסכריד במינון של 1 mg per kg מדי יום במשך שלושה ימים, ומתילן כחול במינון של 5 או 10 mg per kg ניתן 30 דקות לאחר כל מנה. ביום השלישי, רמת IL-6 בסרום הייתה נמוכה יותר בשתי קבוצות המתילן הכחול לעומת הקבוצה שקיבלה ליפופוליסכריד בלבד, בעוד שרוב הציטוקינים האחרים שנבדקו לא השתנו בעקבות הטיפול. היחסים בין STAT3 מזורחן ל-STAT3 הכולל היו נמוכים יותר בקליפת המוח, בהיפוקמפוס ובעור האוזן, לצד צביעה מופחתת של Iba-1 במיקרוגליה, רמות נמוכות יותר של iNOS ו-COX2 ומיתון חלקי של הירידה במשקל.

יש כאן שתי הסתייגויות. ירידה ב-IL-6 בסרום יחד עם ירידה בזרחון STAT3 ברקמות תואמת ויסות של הציר, אך אינה מבודדת את נקודת הפעולה הראשונית: הפחתה בציטוקין במעלה המסלול, הפחתה באיתות הקולטן או שינוי בפעילות פוספטאז יכולים כולם להוביל לאותו יחס. בנוסף, משקל לאורך שלושה ימים של חשיפה חריפה לגורם מפעיל הוא מדד של בעל החיים השלם, לא מדד לתסמינים או להפוגה. הוא מוסיף הקשר מעבר לתוצאת תספיג, בלי להפוך תוצאת איתות לטענה טיפולית. הכימיה הנפרדת של תהליכי חמצון-חיזור במיטוכונדריה מתרחשת במקביל לתהליכי הציטוקינים האלה, ואין לאחד ביניהם.

השוואת מסלולים: נקודות התערבות ומדדים

הטבלה מונעת שלוש הסקות לא תקפות. ממצא על צברי ASC אינו מוכיח ממצא על STAT3. ממצא על קישור STAT1 לפרומוטר של iNOS אינו מוכיח ממצא על STAT3, אף ששני החלבונים שייכים למשפחת STAT. ממצא על IL-6 בסרום אינו מוכיח הפחתה בהרכבת אינפלמזום: בניסוי בצפק, IL-1beta ירד בעוד ש-IL-6 לא ירד. כל שורה דורשת גורם מפעיל ומדד משלה. לכן, בקריאת מחקרים תאיים, מחקרים בבעלי חיים ומחקרים קליניים על מתילן כחול, יש להתאים כל טענה לרמה שבה בוצעה המדידה.

אף אחד מהממצאים האלה אינו מבסס מינון, בטיחות או תועלת בבני אדם. מודלים המבוססים על ליפופוליסכריד מספקים גירוי מבוקר לבדיקת מנגנון, ואינם העתק של מחלה כרונית. מתן חומר לצד הגורם המפעיל בוחן מניעה של שינוי מושרה, ולא היפוך של מחלה שכבר התבססה. יש להפריד בין התיאור המנגנוני הזה לבין תוצאות במטופלים, ולבחון כל טענה בריאותית לפי המחקר במטופלים שעליו היא מבוססת.