מתילן כחול בבדיקות מעבדה ל-G6PD: מה הצבען עושה בפועל

סטודנט מתבונן בשתי מבחנות לאחר הדגרה. אחת קיבלה את הצבע הצפוי. האחרת לא. הסטודנט מסיק שלמטופל השני יש חסר בגלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז. ייתכן שהמסקנה נכונה, אבל ההנמקה מדלגת על העיקרון שמאפשר לבדיקה לפעול. שום דבר במבחנה אינו מודד את האנזים ישירות. המבחנה מודדת את מה שהאנזים מייצר, באמצעות מתילן כחול כמתווך.

ברגע שמבינים שמדובר במדידה עקיפה, ההליך, הבקרות והרשימה הארוכה של תוצאות שגויות כבר אינם נראים שרירותיים.

התשובה הקצרה

מתילן כחול בבדיקות G6PD הוא אינדיקטור חמצון-חיזור. האנזים G6PD מייצר NADPH, ומערכות תלויות-NADPH מחזרות את המתילן הכחול לצורת הלאוקו חסרת הצבע שלו, או משתמשות בו להעברת אלקטרונים. פעילות אנזימטית תקינה מאפשרת חיזור יעיל. פעילות חסרה גורמת לחיזור איטי או חלקי. זהו האות כולו.

שתי שיטות היסטוריות משתמשות באותו צבען, אך נבדלות בנקודת הסיום. אם מבחינים ביניהן, רוב הבלבול נעלם.

שתי בדיקות, צבען אחד, נקודות סיום שונות

הראשונה היא בדיקת החיזור הישיר של מתילן כחול, שתיארו סאס ועמיתיו ושגיבס העריך בהמשך. כאן נקודת הסיום היא הצבען עצמו: מתילן כחול מחומצן, שצבעו כחול, עובר חיזור לכיוון לאוקומתילן כחול חסר צבע, וקצב השינוי משקף את היכולת לייצר NADPH. מאמר הסקר המקורי מופיע ב-PubMed תחת סאס ועמיתיו (1966).

השנייה היא בדיקת ברואר לחיזור מתהמוגלובין. תחילה, נתרן ניטריט מחמצן המוגלובין למתהמוגלובין חום. לאחר מכן מתילן כחול פועל כמתווך בהעברת אלקטרונים: מתילן כחול מחוזר מעביר אקוויוולנטים מחזרים למתהמוגלובין, וכך הופך אותו בחזרה להמוגלובין אדום. לכן נקודת הסיום הנראית לעין היא חום לעומת אדום, ולא כחול לעומת חסר צבע. השיטה המקורית פורסמה ב-ביטאון ארגון הבריאות העולמי (ברואר ועמיתיו, 1960).

תיאור בדיקת ברואר כבדיקה להיעלמות צבעו של הצבען אינו מדויק מבחינה כימית. הצבען עובר מחזורי חמצון-חיזור; ההמוגלובין הוא שמשנה את צבעו. התרשים שלהלן מציג את שני המסלולים.

התגובה שבבסיס הבדיקה

G6PD מזרז את השלב החמצוני הראשון במסלול הפנטוז פוספט:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

תאי דם אדומים בשלים תלויים במידה רבה במסלול זה לצורך אספקת NADPH, כפי שנסקר ב-Blood בידי לוצאטו ועמיתיו (2020). NADPH שומר על גלוטתיון במצב מחוזר ומגן על התא מפני נזק חמצוני. מתילן כחול משתלב במערכת הזאת כקולט אלקטרונים. פעילות מספקת של G6PD מספקת כמות מספקת של NADPH, המאפשרת חיזור יעיל. רמה נמוכה של G6PD קוטעת את השרשרת בחוליה הראשונה שלה.

חשבו על הצבען כעל מד דלק, ולא כעל המנוע. הוא מדווח על אספקת ה-NADPH. כל גורם אחר שמשנה את האספקה הזאת, או את קריאת התוצאה, יכול להזיז את המחוג בלי שום שינוי בגן.

כיצד מתבצע הליך מסוג ברואר

הרכבי הריאגנטים השתנו לאורך העשורים, ולכן אין לטעות ולראות בתיאור לימודי פרוטוקול קליני. כל מעבדה פועלת לפי נוהל העבודה התקני המתוקף שלה. בכפוף להסתייגות זו, מערך המבחנות הקלאסי פועל כך, במתכונת הכוללת שלוש מבחנות והדגרה של 3 שעות, כפי שמתועד ב-יישום זה שפורסם:

1. מבחנת המטופל: דם מלא בתוספת גלוקוז, נתרן ניטריט ומתילן כחול. הניטריט יוצר מתהמוגלובין, הגלוקוז מזין את חילוף החומרים של תאי הדם האדומים, והצבען משמש להעברת אלקטרונים התלויה ב-NADPH.
2. בקרה מחומצנת: דם בתוספת ניטריט וגלוקוז, אך ללא מתילן כחול. היא מציגה את נקודת הסיום החומה של מתהמוגלובין, כלומר את הדפוס האופייני לחסר.
3. בקרת המוגלובין: דם בתוספת מים. היא מציגה את נקודת הסיום האדומה של המוגלובין, כלומר את הדפוס התקין.
4. הדגירו את כל המבחנות בטמפרטורה הקרובה ל-37 C, בדרך כלל למשך 3 שעות, תוך ערבוב עדין.
5. מהלו מנה קטנה מכל מבחנה במים מזוקקים כדי לפרק את התאים ולאפשר השוואת צבעים ברורה.
6. השוו את מבחנת המטופל לשתי הבקרות. חזרה לכיוון האדום מעידה על יכולת חיזור משמעותית. הישארות בגוון הקרוב לחום מצביעה על אפשרות לחסר ניכר.

בהרכב היסטורי אחד השתמשו בכ-1 mL דם ובריאגנטים בריכוזים של כ-180 mM נתרן ניטריט, 280 mM דקסטרוז ו-0.4 mM מתילן כחול. יש להתייחס למספרים האלה כדוגמה מהספרות, ולא כמפרט אחיד.

פענוח התוצאה

בדיקת סקר איכותנית מבחינה בצורה הטובה ביותר סביב 30 עד 40 אחוז מהפעילות התקינה, כפי שנדון ב-סקירה זו ב-Malaria Journal על פערים בזיהוי G6PD. לכן תוצאה תקינה בבדיקת סקר פירושה שהבדיקה לא זיהתה חסר חמור. היא אינה מאשרת שהפעילות תקינה לחלוטין.

מדוע בדיקות סקר עלולות להטעות

רטיקולוציטוזיס לאחר המוליזה הוא המקרה הקלאסי של תוצאה תקינה כוזבת. תאי דם אדומים צעירים ורטיקולוציטים מכילים יותר G6PD מתאי דם זקנים. במהלך אירוע המוליטי חריף, ייתכן שהתאים הזקנים ביותר, שבהם החסר הגדול ביותר, כבר נהרסו, ונותרה אוכלוסייה צעירה שפעילותה נמדדת כתקינה. אותה תופעה ביולוגית מטעה גם בדיקות כמותיות, ולא רק בדיקות סקר המבוססות על צבען.

עירוי דם שניתן לאחרונה מסתיר חסר משום שתאי הדם האדומים של התורם תורמים לדגימה את האנזים שלהם. מעבדות Mayo Clinic מציינות עירוי דם כאחד הגורמים לתוצאות אנזימטיות לא מהימנות, לצד רטיקולוציטוזיס והפרעה מצד לויקוציטים.

נשים הטרוזיגוטיות הן המקרה המורכב ביותר. השתקה אקראית של כרומוזום X יוצרת תערובת של תאי דם אדומים תקינים ותאים בעלי חסר, והפעילות הכוללת יכולה לנוע מחסר חמור ועד פעילות שנראית תקינה. בדיקות סקר איכותניות מחמיצות לעיתים קרובות פנוטיפים של ביניים. התיעוד של ארגון הבריאות העולמי בנושא בדיקות G6PD דן במגבלה הזאת בפירוט.

גיל הדגימה, טמפרטורת האחסון, הסובייקטיביות בהערכת נקודת הסיום החזותית, ההמטוקריט ואיכות הריאגנטים מוסיפים רעש אנליטי על ההשפעות הביולוגיות האלה.

בדיקת סקר אינה אבחנה

תוצאת סקר המעידה על חסר, על פעילות ביניים או שאינה תואמת את התמונה הקלינית מחייבת בדיקה כמותית של פעילות האנזים G6PD. ארגון הבריאות העולמי רואה בספקטרופוטומטריה כמותית בטמפרטורה מבוקרת את שיטת הייחוס. בבדיקה זו מוסיפים גלוקוז-6-פוספט ו-NADP+ להמוליזט של תאי דם אדומים, ועוקבים אחר ה-NADPH שנוצר באמצעות העלייה בבליעה ב-340 nm. קצב השינוי יחסי לפעילות האנזים, ובדרך כלל מנורמל לכמות ההמוגלובין ומבוטא ביחידות לגרם. הנוהג העדכני במעבדות קליניות מסוכם ב-רשומה לפעילות G6PD בקטלוג הבדיקות של Mayo.

הפענוח מבוסס על טווח הייחוס המתוקף של המעבדה, שלעיתים קרובות מוגדר ביחס לפעילות התקינה באוכלוסייה. מקובל לדון בחסר סביב סף של 30 אחוז, ובפעילות ביניים מעליו. פרופילי מוצרי היעד של ארגון הבריאות העולמי לבדיקות G6PD ‏(2022) מפרטים את המסגרת האבחונית הזאת. אם המוליזה או עירוי דם שהתרחשו לאחרונה הופכים את קביעת הפנוטיפ ללא מהימנה, יש לחזור על הבדיקה לאחר שאוכלוסיית תאי הדם האדומים מתאזנת מחדש. בדיקה מולקולרית יכולה להוסיף מידע, אך אינה מחליפה את מדידת האנזים.

הבחנה שחשוב לשמור עליה

מתילן כחול בבדיקות האלה הוא ריאגנט מעבדתי לשימוש מחוץ לגוף. עובדה זו שייכת לדיון שונה מסוגיית הבטיחות של מתן מתילן כחול למטופל, הנידונה ב-הנחיות בנושא התוויות נגד למתילן כחול. הביוכימיה מקשרת ביניהם, משום שגם התרופה תלויה בחיזור תלוי-NADPH, אבל צבען במבחנה אינו מנה במחזור הדם. למידע על התנהגות הצבען כחומר צביעה בהקשר אחר, ראו עקרונות הצביעה במתילן כחול, ולמידע על המשפחה הכימית שאליה הוא משתייך — צבעוני חמצון-חיזור במעבדה.

בדיקת סקר שואלת אם יכולת החיזור נראית תקינה. בדיקת אימות שואלת כמה אנזים יש בפועל. הצבען משרת היטב את השאלה הראשונה, כל עוד איש אינו מבקש ממנו לענות על השנייה.