מתילן כחול לצביעת DNA ו-RNA: יישומים בג'לים ובממברנות

סטודנט מריץ ג'ל אגרוז, צובע אותו במתילן כחול ואינו רואה דבר במקום שבו ציפה לפס בולט. בעמדת העבודה הסמוכה, חוקר בתר־דוקטורט צובע ממברנת נורת'רן באותו בקבוק כחול ומקבל פסים ריבוזומליים חדים בתוך שלוש דקות. הסטודנט מסיק שהג'ל נכשל. הג'ל לא נכשל. המשימות היו שונות, ואותו צבע נותן להן מענה ברגישות שונה, ברקע שונה ובכללים שונים לגבי השלבים הבאים.

צביעת DNA במתילן כחול וצביעת RNA במתילן כחול מבוססות על אותה כימיה, אך אינן משרתות אותה מטרה. בג'ל, הצבע מעיד על כמות חומצת הגרעין הנמצאת בתוך מטריצה נקבובית. על ממברנה, הוא מעיד אם ההעברה הצליחה ואם המסלולים הוטענו באופן אחיד. ברגע שההבחנה הזאת ברורה, הפרוטוקולים, ספי הגילוי ומגבלות התאימות נעשים מובנים.

התשובה הקצרה

מתילן כחול הוא צבע קטיוני מישורי הנקשר לחומצות גרעין באופן לא־קוולנטי והפיך, באמצעות שילוב של משיכה אלקטרוסטטית לפוספט, אינטרקלציה בין זוגות בסיסים וקישור לחריץ הקטן. ההפיכות הזאת היא העיקר. אפשר לצבוע פסים, לצפות בהם באור נראה ולתעד אותם, ואז להסיר את הצבע או לטהר את הדגימה לצורך שיבוט, הכלאה או בדיקה חוזרת עם גלאי.

לצביעת DNA דו־גדילי במתילן כחול בג'ל אגרוז, המתכון המהיר המקובל הוא 0.02 אחוז w/v ‏(200 מיקרוגרם לכל mL) במים, כ-15 דקות צביעה ועוד כ-15 דקות של הסרת צבע במים, עם צפייה על משטח תאורה באור לבן. לממברנות, המתכון הקלאסי לבלוט נורת'רן הוא 0.02 עד 0.04 אחוז צבע בנתרן אצטט, בסביבות pH 5.2, כמה דקות צביעה לאחר העברה וקיבוע, ואז שטיפה במים והסרה מלאה של הצבע לפני הכלאה. הרגישות מוגבלת: עשרות עד מאות ננוגרם לכל פס בג'ל בתנאים טובים, ומדריכים שמרניים מציינים 0.5 עד 1 מיקרוגרם. אלו כמויות הגבוהות בסדרי גודל מספי הגילוי של אתידיום ברומיד וצבעי SYBR. על ממברנות אין סף גילוי יחיד שימושי לתעתיק, משום שהצביעה מראה בעיקר RNA ריבוזומלי המצוי בשפע ואת כלל החומר שהוטען. אין להחליף את הצבע באף אחד מהמתכונים בתמיסת תוסף הנמכרת לצרכנים. שיטות שעברו תיקוף מניחות שימוש בצבע בדרגה אנליטית, בבופרים מוגדרים ובעבודה נקייה מ-RNase כאשר מעורב RNA.

כיצד הקישור פועל, והיכן הוא מטעה

המודל השימושי כולל שלושה חלקים. ראשית, מערכת הטבעות בעלת המטען החיובי נמשכת לשלד הפוספט בעל המטען השלילי. מחקרים ספקטרוסקופיים מוצאים שהרכיב האלקטרוסטטי הזה דומיננטי בריכוזי מלח נמוכים, ואילו מידול ודינמיקה מולקולרית מצביעים על אינטרקלציה ועל קישור לחריץ הקטן כאופני קישור יציבים ל-DNA דו־גדילי, כפי שמסוכם במחקר ספקטרוסקופי על קישור מתילן כחול ל-DNA. שנית, קיימת העדפה מסוימת ל-GC: המידול מצביע על העדפה לצעדי CpG ו-GpC, וניסויים מדווחים על קישור מועדף למבנים דו־גדיליים עשירים ב-GC במחקר על העדפות האינטרקלציה של מתילן כחול, אך גם מבנים דו־גדיליים של AT קושרים את הצבע. צביעה שגרתית אינה ייחודית לרצף. שלישית, DNA חד־גדילי ו-RNA נקשרים בעיקר באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות וערימה עם בסיסים נגישים ואזורים דו־גדיליים, ולכן עוצמת הצביעה משתנה בהתאם לאורך, לרצף ולמבנה השניוני.

מכאן נובעות שתי השלכות. מכיוון שהקישור אינו קוולנטי, הצבע נשטף החוצה. פסים בפוליאקרילאמיד דוהים במהירות אלא אם מקבעים אותם במכוון, וגרסה ייעודית לקיבוע קבוע קיימת בדיוק משום שהצביעה הרגילה זמנית, כפי שתיארו סוטו ודרייפר עבור ג'לי PAGE. מכיוון שהצבע הוא פוטוסנסיטייזר, הארה חזקה וממושכת של DNA צבוע בנוכחות חמצן עלולה לחמצן גואנין ובסופו של דבר ליצור שברים חד־גדיליים, מנגנון המפורט במחקר על חמצון גואנין המתווך על ידי מתילן כחול בהארה. צפייה קצרה באור לבן מונעת את נזקי ה-UV המוכרים מתהליכי העבודה הקלאסיים עם אתידיום ברומיד, וזהו יתרון ממשי בהפקת חומר להמשך עבודה. אור נראה עדין יותר, אך אינו נטול נזק. הקפידו על הארה קצרה כאשר ה-DNA מיועד לשיבוט. לפוטוכימיה הרחבה יותר שמאחורי האזהרה הזאת, ראו שני המסלולים בפוטוכימיה של מתילן כחול. לזוג החמצון־חיזור ולמצבי המטען המסבירים מדוע הצורה המחומצנת נקשרת והצורה המחוזרת אינה נקשרת, ראו הכימיה של המבנה והתכונות של מתילן כחול.

משימה ראשונה: צביעה בתוך ג'לים

צביעת ג'ל עונה על שאלה אחת: האם יש בפס הזה מספיק חומצת גרעין כדי לראות אותה בעין. DNA דו־גדילי באגרוז הוא המקרה שנחקר בצורה המקיפה ביותר. שיטת צביעת הג'ל המקורית במתילן כחול של פלורס ועמיתיו תיקפה את הפרוטוקול המהיר בריכוז 0.02 אחוז באגרוז בריכוז 1 אחוז, והדגימה הפקה ושיבוט מוצלחים לאחר מכן. אותו פרוטוקול של הספק מופיע בדף המוצר של מתילן כחול של IBI Scientific, המציג זה לצד זה את המתכון לממברנות בריכוז 0.04 אחוז ואת הגרסה המהירה לג'לים.

תהליך עבודה מעשי:

1. הריצו את הג'ל כרגיל. צבעו לאחר האלקטרופורזה, לא במהלכה, אלא אם ההעברה או ההפרדה תוקפו עבור שיטה מותאמת.
2. טבלו במתילן כחול בריכוז 0.02 אחוז w/v במים מזוקקים, עם טלטול עדין, למשך כ-15 דקות.
3. הסירו את הצבע בכמה החלפות מים, במשך כ-15 דקות בסך הכול, עד שרקע המטריצה נחלש והפסים בולטים.
4. צלמו ללא דיחוי על משטח תאורה באור לבן.

אגרוז ופוליאקרילאמיד מתנהגים באופן שונה. אגרוז שומר צבע במטריצה, ולכן הסרת הצבע היא השלב האיטי. ג'לי פוליאקרילאמיד דקים נצבעים במהירות, אך גם מאבדים צבע במהירות, דבר שמסייע בחיתוך פסים לצורך הפקת חומר אך פוגע בתיעוד ארכיוני. אפשר לאתר אוליגונוקלאוטידים סינתטיים בפוליאקרילאמיד בעזרת אותו מתכון בריכוז 0.02 אחוז בתוך 20 עד 30 דקות, עם שטיפות חוזרות במים, בהתאם לשיטות PAGE מבוססות בנוסח Current Protocols. דווח גם על גרסאות מדוללות מאוד, בסביבות 0.0002 אחוז ב-TBE מדולל, להפקת אוליגונוקלאוטידים במשך כמה שעות, אך בסיס הראיות שלהן חלש יותר.

ההבדל בין DNA ל-RNA חשוב. DNA דו־גדילי מציג את הקישור המבני החזק ביותר. RNA ו-DNA חד־גדילי נצבעים, אך בצורה חלשה יותר ופחות צפויה. בג'לי אגרוז עם פורמלדהיד ל-RNA, רוב המעבדות מוותרות על צביעה כחולה בתוך הג'ל ומעבירות קודם את ה-RNA לממברנה, ואז צובעות שם. המעבר הזה מחליף אות חלש בג'ל באות חד יותר על הממברנה, יחד עם תיעוד ההטענה.

משימה שנייה: צביעה על ממברנות

צביעת ממברנות עונה על שאלה אחרת: האם ההעברה הצליחה, והאם המסלולים בני השוואה. היישום הקלאסי הוא צביעת בלוט נורת'רן ההפיכה של הרין ושמידט, שבמקור השתמשה בצבע בריכוז 0.04 אחוז בנתרן אצטט בריכוז 50 mM ב-pH 5.0 למשך 2 עד 3 דקות, עם שטיפה במים והסרת הצבע באמצעות SDS מדולל ב-SSPE לפני הכלאה.

הגרסה המודרנית הנפוצה מתבצעת כך:

1. העבירו RNA או DNA שעבר דה־נטורציה לניילון או לניטרוצלולוז, ואז קבעו באמצעות צילוב ב-UV או אפייה, כדי שהדגימה לא תאבד במהלך הצביעה.
2. שלב אופציונלי אך נפוץ: הרטיבו את הממברנה בחומצה אצטית בריכוז 5 אחוז למשך כ-15 דקות.
3. צבעו במשך 5 עד 10 דקות במתילן כחול בריכוז 0.02 עד 0.04 אחוז, בנתרן אצטט בריכוז 0.3 עד 0.5 M, בסביבות pH 5.2.
4. שטפו והסירו צבע במים במשך 5 עד 15 דקות, תעדו, ואז הסירו שאריות צבע לפני ההכלאה.

ניילון בעל מטען חיובי הוא הממברנה הנפוצה ביותר בעבודת נורת'רן. גם ניטרוצלולוז מתאים לאותו תהליך עבודה המבוסס על חומצה אצטית ואצטט. התמונה משמשת לאימות ההעברה, להשוואת פסי 28S ו-18S ‏(או 23S ו-16S ב-RNA חיידקי), לסימון סולמות וסטנדרטים ולשמירת תיעוד מקורב לנרמול לפי כלל ה-RNA. שיטות נורת'רן שפורסמו מכמתות פסים ריבוזומליים צבועים לבדיקת ההטענה, כולל מחקר בתחום מדעי החלב שהשתמש בפסים ריבוזומליים שנצבעו במתילן כחול לצורך נרמול. אפשר להמחיש באותו אופן גם ממברנות סאות'רן, אך השימוש בצבע מבוסס הרבה יותר כבדיקת הטענה והעברה בנורת'רן. נוסף על כך, DNA בסאות'רן עובר דה־נטורציה לפני ההעברה, ולכן נתוני הרגישות של הג'ל אינם חלים עליו.

ספי גילוי ורקע: היכן הכחול נופל מאחור

ההשוואה שלהלן מקורבת במכוון. ביצועי הצביעה תלויים באחוז הג'ל, ברוחב הפס, באופטיקה ובהקפדה על הסרת הצבע. התייחסו לכל מספר כסדר גודל, לא כמפרט.

בקרת הרקע קובעת אם האות המוגבל שימושי. לצבע חופשי יש צבע עז, ולכן הניגודיות נוצרת מהסרת צבע לא־קשור בלי להסיר את הצבע הקשור. צבע מרוכז יותר משפר את הרגישות רק לעיתים רחוקות. הוא בעיקר מאריך את זמן הסרת הצבע. הריצו סדרת מיהולים עם הג'ל, הממברנה והמצלמה המדויקים שבהם אתם משתמשים, והשתמשו רק בטווח שבו הצפיפות המשולבת נשארת ביחס ישר לכמות שהוטענה. מתילן כחול מתאים לנרמול חצי־כמותי של ההטענה. הוא אינו בדיקה כמותית בעלת טווח דינמי רחב, משום שקיבולת הממברנה, יעילות ההעברה, הרוויה והסרת הצבע משתנות ממסלול למסלול.

מגבלות התאימות: מה שורד את הצביעה

הודגם שיבוט לאחר צביעה בכחול. פלורס ועמיתיו חתכו פסים צבועים מג'ל אגרוז, הפיקו את ה-DNA, ביצעו בו ליגציה וטרנספורמציה, ודיווחו על שיבוט טוב יותר מאשר לאחר שימוש באתידיום ברומיד עם UV. הסיבה הסבירה היא פחות נזק פוטוכימי, ולא תועלת מהצבע עצמו. הקפידו על חשיפה קצרה לאור לבן והעבירו את ה-DNA שהופק דרך תהליך טיהור רגיל להפקה מג'ל.

הראיות לגבי PCR וריצוף מצומצמות יותר. שאריות צבע נקשרות לחומצות גרעין, ולכן יש להסיר את הצבע ולטהר לפני שלבים אנזימטיים. DNA שטוהר כראוי מג'ל שנצבע בכחול צפוי להתאים, אך הסבילות להעברה ישירה של שאריות צבע בפולימראזות ובכימיות ריצוף שונות אינה מכומתת היטב. אל תניחו שהיא קיימת.

הכלאה בבלוט תואמת לצביעה כאשר מקפידים על הסדר: העברה, קיבוע, צביעה, תיעוד, הסרת צבע, הכלאה. זהו הרצף שתכננו הרין ושמידט. צביעה לפני ההעברה, או דילוג על הסרת הצבע, היא שיטה אחרת המחייבת תיקוף משלה. לאחר הסרת הצבע, הסרה רגילה של הגלאי ובדיקה חוזרת עם גלאי מתבצעות כרגיל. לצביעה ברמת התא באותה משפחת צבעים, ולהסבר מדוע ההיגיון של משטח מקובע אינו חל על שיטות לתאים חיים, ראו אטלס הצביעה למיקרוסקופיה.

חיתוך פסים מתאים להפקת חומר מג'לי אגרוז ולאוליגונוקלאוטידים ב-PAGE שאותרו באמצעות כחול, בתנאי שנמנעים מגרסת הקיבוע הקבוע. אלוציה חשמלית לאחר הסרת הצבע סבירה מבחינה כימית עבור חומר קושר הפיך, אך נתוני תפוקה מבוקרים הייחודיים למתילן כחול מעטים. הסירו מלחים או שקעו את החומר לאחר האלוציה.

כשלים שחוזרים על עצמם

פסים חלשים בג'ל מעידים בדרך כלל על מסה קטנה מדי לצביעה קולורימטרית, במיוחד במטרות קצרות של חומצות גרעין חד־גדיליות או RNA. הטעינו יותר חומר, השתמשו בתמיסת צבע טרייה, האריכו את הצביעה לפני העלאת הריכוז, והפסיקו את הסרת הצבע מוקדם יותר. ג'ל כחול אחיד ללא ניגודיות מעיד בדרך כלל על צביעת יתר או על מעט מדי החלפות מים. דהייה של פסים ב-PAGE היא תוצאה כימית צפויה, לא כישלון בצביעה. צלמו במהירות. רקע לא אחיד בממברנה מצביע על קפלים, בועות, טביעות אצבע, טלטול לא אחיד או העברה לא אחידה. אל תפרשו זאת כהטענה לא שווה ללא בקרת הכלאה. דפוס ריבוזומלי חלש ומרוח עשוי להעיד על פירוק, אך גם על העברה לא מלאה, על מעט מדי RNA כולל (מסלולים טיפוסיים מכילים כמה עד עשרות מיקרוגרם), או על הסרת צבע מופרזת. הצבע מעיד על RNA ריבוזומלי המצוי בשפע. הוא אינו מעיד על תעתיק מסוים. זהו תפקידו של הגלאי.

בטיחות וטיפול בלי להפריז בטענות

הטיפול במתילן כחול פשוט יותר מאשר באתידיום ברומיד, אך הוא אינו נטול סיכון. גיליון נתוני בטיחות עדכני של MilliporeSigma מסווג את הצבע כבעל רעילות חריפה בבליעה, קטגוריה 4, מזיק בבליעה, ומורה על פינוי במסלול פסולת מאושר בהתאם לגיליון נתוני הבטיחות של Sigma-Aldrich למתילן כחול. לאתידיום ברומיד יש אזהרות חמורות יותר בנוגע לרעילות גנטית, לרבות חשד להשפעות על תאי נבט בגיליון נתוני הבטיחות של Sigma-Aldrich לאתידיום ברומיד, וג'לים ותמיסות המכילים אותו מופרדים בדרך כלל כפסולת כימית מסוכנת, כפי שמצוין במדריך Thermo Fisher לצבעי חומצות גרעין. פעלו לפי גיליונות נתוני הבטיחות ולפי כללי המוסד עבור שני החומרים. שמרו את הצבע היבש כשהוא סגור היטב ויבש, השתמשו מחדש בתמיסת העבודה רק כפי שהפרוטוקול מתיר, אחסנו ממברנות צבועות במצב יבש בין גיליונות נייר סינון, וצלמו ג'לים לפני שהפסים מתפזרים בדיפוזיה.

זכרו את משפט המפתח לעבודה במעבדה. ג'לים בוחנים נראות בהטענה גבוהה תחת אור לבן. ממברנות בוחנות העברה והטענה לפני שהגלאי מבצע את העבודה הרגישה. צבע אחד משרת את שתי המטרות, עם רגישות מוגבלת, קישור הפיך וסדר פעולות קפדני.