મિથિલીન બ્લુને કોષીય શ્વસન સાથે જોડનારા પ્રયોગો

ફાઇબ્રિન દૂર કરેલું માનવ રક્ત, ત્રણ કલાક સુધી 37 °C પર ગરમ રાખવામાં આવે ત્યારે, તેમાં રહેલા ઑક્સિજનનો આશરે બે ટકા ભાગ વાપરે છે. ઇન્ક્યુબેશન પહેલાં તેમાં મિથિલીન બ્લુની થોડી માત્રા ઉમેરો, તો એ જ રક્ત આશરે પાંસઠ ટકા ઑક્સિજન વાપરે છે. કોષોમાં કશું બદલાયું નહોતું. માત્ર દ્રાવણ બદલાયું હતું.

આ આંકડો જૉન્સ હોપકિન્સ ખાતે જ્યોર્જ હેરોપ અને ઈ. એસ. ગુઝમેન બેરોનના 1928ના સંશોધનપત્રમાંથી આવે છે. મિથિલીન બ્લુ કોષીય શ્વસન સુધારે છે એવું વારંવાર કહેવાતું નિવેદન અહીંથી ઉદ્ભવ્યું છે. આ નિવેદન ખોટું નથી, પણ તેનો અર્થ જેટલો વ્યાપક લાગે છે, તેટલો નથી.

કોષ્ટકનો આંકડો ખરેખર શું માપે છે

માપવાનું અંતિમ પરિણામ ઑક્સિજનનો ઉપગ્રહણ હતો, જે ગૅસ વિશ્લેષણથી નક્કી કરાયો હતો. હેરોપ અને બેરોને તાજું લીધેલું રક્ત 10 °C પર રૂમાંથી ગાળીને શ્વેત રક્તકોષો દૂર કર્યા, નમૂનાને ઑક્સિજનથી સંતૃપ્ત કર્યો, તેને બે ભાગમાં વહેંચ્યો, એક ભાગમાં રંગદ્રવ્ય ઉમેર્યું અને ઇન્ક્યુબેશન પછી બંનેનું વિશ્લેષણ કર્યું. શ્વેત રક્તકોષોની સંખ્યા ભાગ્યે જ પ્રતિ ઘન મિલિમીટર આશરે એક હજારથી વધુ હતી. ઑક્સિજનનો વપરાશ નમૂનામાં શરૂઆતમાં રહેલા ઑક્સિજનમાંથી ગાયબ થયેલા હિસ્સા તરીકે નોંધાયો હતો.

તેમણે કાર્બન ડાયૉક્સાઇડ પણ માપ્યો, પરંતુ ત્યાં પદ્ધતિએ મુશ્કેલી ઊભી કરી. ફાઇબ્રિન દૂર કરેલું રક્ત ઇન્ક્યુબેશનના પહેલા કલાકમાં પ્રતિ 100 mL બે મિલિમોલ સુધી કાર્બન ડાયૉક્સાઇડ છોડતું હતું, અને તેના કારણો અભ્યાસ હેઠળની પ્રતિક્રિયા સાથે સંબંધિત નહોતાં. તેથી સંપૂર્ણ રક્તમાંથી મેળવેલા શ્વસન ગુણોત્તરો ઉપયોગી નહોતાં. લૉકના દ્રાવણમાં રાખેલા ધોયેલા કોષોમાંથી જ અર્થઘટન કરી શકાય એવા આંકડા મળ્યા, અને રંગદ્રવ્ય સાથે તથા તેના વિના તે 0.73 અને 0.80 વચ્ચે કેન્દ્રિત હતા.

આ વિગત મામૂલી નથી. આ સંશોધનપત્રોમાં “શ્વસન”નો અર્થ બંધ પાત્રમાં ગૅસનું વિનિમય છે. ઑક્સિજનના વપરાશ અને ઉપયોગી ઊર્જાના ઉત્પાદન વચ્ચેનો તફાવત ઑક્સિજનનો વપરાશ ATP વિશે શું જણાવે છે અને શું નથી જણાવતો તેમાં અલગથી તપાસવામાં આવ્યો છે.

જે કોષો સૌથી ઓછું શ્વસન કરતા હતા, તેમાં રંગદ્રવ્યએ સૌથી વધુ વધારો કર્યો

સસ્તન પ્રાણીઓના પરિપક્વ લાલ રક્તકોષોમાં લગભગ કોઈ માપી શકાય એવો ઑક્સિજન વપરાશ હોતો નથી. કેન્દ્રક ધરાવતા પક્ષીઓના લાલ રક્તકોષોમાં હોય છે. હેરોપ અને બેરોને બંને પર પ્રયોગ કર્યા, અને આ તફાવત તેમની દલીલનો મુખ્ય આધાર છે.

સસ્તન પ્રાણીઓના નમૂનાઓમાં રંગદ્રવ્યએ વીસથી પચાસ ગણો વધારો કર્યો. હંસના રક્તમાં, જેના કોષો પહેલેથી જ શ્વસન કરતા હતા, તેણે દરને ક્યારેય બમણાથી વધુ વધાર્યો નહીં. શરૂઆતનું શ્વસન જેટલું વધુ, રંગદ્રવ્યથી શક્ય વધારો તેટલો ઓછો.

એક જ પ્રજાતિમાં પણ આ જ ક્રમ દેખાય છે. પોલિસાઇથેમિયા વેરા ધરાવતા દર્દીના માનવ રક્તના નમૂનામાં અપરિપક્વ કોષો હતા; રંગદ્રવ્ય વિના તેણે તેના ઑક્સિજનનો 11.3 ટકા ભાગ વાપર્યો, જ્યારે સ્વસ્થ દાતાના ધોયેલા કોષોએ 2.8 ટકા વાપર્યો. રંગદ્રવ્યએ તેને માત્ર 63.4 ટકા સુધી પહોંચાડ્યો—છ ગણો વધારો, જ્યારે સામાન્ય કોષોમાં લગભગ ત્રીસ ગણો વધારો થયો. રંગદ્રવ્યએ પરિપક્વ કોષોને અપરિપક્વ કોષો જેવા વર્તન તરફ ધકેલ્યા, અને લેખકોએ પણ તે આમ જ કામ કરતું હોવાનું કહ્યું હતું.

સાયનાઇડે તેને રોકવું જોઈતું હતું

સાયનાઇડ કોષીય ઑક્સિડેશન રોકે છે તે જાણીતું હતું. તેમ છતાં હેરોપ અને બેરોને રંગદ્રવ્યની સાથે તેને ઉમેર્યું.

ગૌવંશના રક્તનાં પરિણામો આનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. કંઈ ઉમેર્યા વિના ત્રણ કલાકમાં ઑક્સિજનનું પ્રમાણ 22.61થી ઘટીને 22.03 વોલ્યુમ ટકા થયું. મિથિલીન બ્લુ સાથે તે ઘટીને 12.84 થયું. મિથિલીન બ્લુ અને એક પાંચ-હજારમા મોલર પોટેશિયમ સાયનાઇડ સાથે તે ઘટીને 12.74 થયું. રંગદ્રવ્યની અસર પર મૂળભૂત રીતે કોઈ અસર પડી નહીં.

આકૃતિ: માનવ લાલ રક્તકોષોના સૂક્ષ્મ-શ્વસનનો સતત રેકોર્ડ. તીર મિથિલીન બ્લુ ઉમેરવાનો બિંદુ દર્શાવે છે. તે પહેલાં રેખા લગભગ સપાટ છે; ત્યાર પછી તે સતત ઉપર જાય છે. હેરોપ અને બેરોન, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478માંથી પુનઃપ્રસ્તુત.

તેમનું તારણ હતું કે રંગદ્રવ્ય ઑક્સિજનવાહક તરીકે કામ કરતું હતું, “પુખ્ત સસ્તન પ્રાણીઓના કેન્દ્રક વિનાના લાલ રક્તકોષોમાંથી ગાયબ થઈ ગયેલો પદાર્થ પૂરો પાડીને.” બે વર્ષ પછી, રોકફેલર ઇન્સ્ટિટ્યૂટના માઇકેલિસ અને સલોમોને આ મતભેદને તેનું કાયમી સ્વરૂપ આપ્યું. કાં તો રંગદ્રવ્યની અસર “રંગદ્રવ્યનો એક આકસ્મિક ગુણધર્મ” હતી, અથવા રંગદ્રવ્ય “જીવોમાં રહેલા કોઈ અજ્ઞાત પદાર્થનું મોડેલ” હતું. આ બે શક્યતાઓ વચ્ચેનો પ્રશ્ન હજી ઉકેલાયો નથી. બદલાયું એટલું છે કે હવે કોષોનું વર્ણન ઘણી વધુ ચોકસાઈથી કરી શકાય છે.

યકૃતના અર્કે પણ એ જ કર્યું

માઇકેલિસ અને સલોમોને બતાવ્યું કે અંગોના ઠંડા પાણીમાં બનાવેલા અર્ક પણ એ જ ઉત્તેજન પેદા કરે છે. ઉંદરના યકૃતનો અર્ક સૌથી વધુ અસરકારક હતો, ત્યાર પછી મૂત્રપિંડ, બરોળ અને વૃષણના અર્ક આવ્યા. મગજ, સ્નાયુ અને રક્તસીરમની અસર બહુ ઓછી અથવા બિલકુલ નહોતી.

પછી તેમણે કાર્બન મોનોક્સાઇડની હાજરીમાં અર્કનું પરીક્ષણ કર્યું. અર્ક અથવા રંગદ્રવ્યથી પ્રેરિત શ્વસન 98 ટકા કાર્બન મોનોક્સાઇડ અને 2 ટકા ઑક્સિજનના મિશ્રણમાં પણ બદલાયું નહીં. એ જ ગૅસ મિશ્રણે યીસ્ટનું અને કેન્દ્રક ધરાવતા પક્ષીઓના લાલ રક્તકોષોનું શ્વસન આશરે 60થી 80 ટકા અવરોધ્યું, જે કાર્બન મોનોક્સાઇડ પ્રત્યે સંવેદનશીલ શ્વસન ઉત્સેચક વિશેના વૉરબર્ગના વર્ણન સાથે સુસંગત હતું. તેથી પેશીમાં રહેલો આ અજ્ઞાત પદાર્થ વૉરબર્ગનો ઉત્સેચક નહોતો.

આ દરમિયાન પદાર્થની ઓળખ અંગેની કેટલીક સંભાવનાઓ નકારી કાઢવામાં આવી. અપચયિત ગ્લુટાથાયોન અને સિસ્ટીને પોતાના ઑક્સિડેશન માટે જરૂરી હોય એટલો જ ઑક્સિજન વપરાશ કરાવ્યો. હાર્ડન અને યંગનો સહઉત્સેચક બાકાત કરાયો, કારણ કે તે સ્નાયુમાં સૌથી વધુ હોય છે, છતાં સ્નાયુએ લગભગ સૌથી ઓછી અસર દર્શાવી હતી. થોડાં વર્ષ પહેલાં નામ અપાયેલું કાઇલિનનું સાઇટોક્રોમ પણ એ જ વિરોધાભાસમાં અટવાયું. સક્રિય પદાર્થ કોષના કેન્દ્રકમાંથી આવતો હોવાની પોતાની ધારણાને તેમણે માત્ર એક સૂચન ગણાવ્યું.

અસર માટે કેટલીક શરતો જરૂરી હતી

કોષો અખંડ હોવા જરૂરી હતા. નિસ્યંદિત પાણી અથવા વારંવાર હિમન દ્વારા થયેલા હીમોલિસિસે રંગદ્રવ્ય અને અર્ક બંને પ્રત્યેનો પ્રતિભાવ નાબૂદ કર્યો, અને આંશિક હીમોલિસિસે તેના પ્રમાણમાં પ્રતિભાવ ઘટાડ્યો.

શર્કરા પણ જરૂરી હતી. ગ્લુકોઝ, ફ્રુક્ટોઝ અને સુક્રોઝે રંગદ્રવ્યથી પ્રેરિત શ્વસનને ટેકો આપ્યો; મેનિટોલે નહીં. શર્કરા ન હોય ત્યારે બિલકુલ શ્વસન થતું નહોતું, અને આ પ્રક્રિયામાં રંગદ્રવ્ય કોષોને નુકસાન પહોંચાડતું હોય એવું લાગતું હતું. તેથી એક કે બે કલાક પછી ઉમેરાયેલો ગ્લુકોઝ પણ શ્વસન પુનઃસ્થાપિત કરી શક્યો નહીં. લેખકોએ સૂચવ્યું કે રંગદ્રવ્ય કોષને જરૂરી એવા કોઈ સંરચનાત્મક ઘટકનું ઑક્સિડેશન કરી રહ્યું હતું.

પ્રકાશથી રંગદ્રવ્યની અસર નોંધપાત્ર રીતે વધી, જોકે અંધારામાં પણ અસર સ્પષ્ટ હતી. અન્ય અપચય પામી શકતાં રંગદ્રવ્યોનું વર્તન અલગ હતું: ટોલ્યુઇલીન બ્લુએ મિથિલીન બ્લુ જેટલી કે તેનાથી વધુ અસર કરી, જ્યારે ઇન્ડિગો ડિસલ્ફોનેટે લગભગ કંઈ કર્યું નહીં. રંગદ્રવ્યના ઑક્સિડેશન-અપચય વિભવ અને તેની અસરના પ્રમાણ વચ્ચે કોઈ સ્પષ્ટ સંબંધ જણાયો નહીં; લેખકોએ તેનું કારણ પટલની પારગમ્યતા અને ઝેરીપણું ગણાવ્યું.

અસર આથવણ સાથે જોડાયેલી હતી, શ્વસન સાથે નહીં

બેરોનના 1930ના અભ્યાસમાં કોષોના નિલંબનને બદલે ઉંદરના સામાન્ય અંગોની પેશીઓના પાતળા ટુકડાઓ અને પ્રત્યારોપિત ગાંઠોનો ઉપયોગ થયો.

ઑક્સિજનની હાજરીમાં ગ્લાયકોલિસિસ ન કરતી પેશીઓમાં મિથિલીન બ્લુએ કંઈ કર્યું નહીં અથવા ઑક્સિજનના વપરાશમાં થોડો ઘટાડો કર્યો: મૂત્રપિંડમાં આશરે 14 ટકા, સ્વાદુપિંડમાં આશરે 14 ટકા અને યકૃતમાં આશરે 5 ટકા. ઑક્સિજનની હાજરીમાં આથવણ કરતી પેશીઓમાં તેણે વપરાશ વધાર્યો: બરોળમાં આશરે 8 ટકા અને મગજમાં આશરે 13 ટકા. ગાંઠોમાં વધારો માનવ સ્તનના કાર્સિનોમામાં આશરે 27 ટકાથી લઈને રાઉસ મરઘીના સાર્કોમામાં 80 ટકાથી વધુ હતો, અને તે લગભગ દરેક પેશીના ઑક્સિજનની હાજરીમાં થતા ગ્લાયકોલિસિસના પ્રમાણમાં હતો.

આકૃતિ: દરેક બિંદુ એક પેશીપ્રકાર દર્શાવે છે. આડી અક્ષ ઑક્સિજનની હાજરીમાં થતું ગ્લાયકોલિસિસ દર્શાવે છે; ઊભી અક્ષ મિથિલીન બ્લુ પછી ઑક્સિજનના વપરાશમાં થતો ફેરફાર દર્શાવે છે. બેરોન, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), કોષ્ટક 6, PMID 19869777માંથી આંકડા.

ત્યાર પછી સાયનાઇડના પ્રયોગે ઊલટું ચિત્ર રજૂ કર્યું. અગાઉ પ્રતિભાવ ન આપતી આ પેશીઓમાં સાયનાઇડથી શ્વસન અવરોધાયું અને આથવણ દેખાવા લાગી ત્યારે રંગદ્રવ્યએ ફરી ઑક્સિજનનો વપરાશ વધાર્યો: મૂત્રપિંડમાં આશરે 59 ટકા, યકૃતમાં આશરે 19 ટકા, બરોળમાં આશરે 286 ટકા અને વૃષણમાં આશરે 200 ટકા.

બેરોને પ્રસ્તાવ મૂક્યો કે રંગદ્રવ્ય કોષ અથવા પેશીની આથવણ કરવાની ક્ષમતા માપવાની કસોટી બની શકે. અંતે તેમણે એક અનુમાન રજૂ કર્યું: રંગદ્રવ્ય ધરાવતા માધ્યમમાં ગાંઠના કોષોની પેઢીઓ ઉછેરવાથી કદાચ એક દિવસ ગાંઠનું ચયાપચય કાયમી રીતે સામાન્ય પેશી જેવું બની શકે. આ 1930માં લખાયેલો સંશોધનનો પ્રશ્ન હતો. તે સારવાર અંગેનો દાવો નથી.

આ પ્રયોગો શું માપતા હોઈ શકે જ નહીં

1928 અને 1930માં “શ્વસન”નો અર્થ ઑક્સિજનનો વપરાશ હતો. એડેનોસિન ટ્રાઇફૉસ્ફેટનો પ્રથમ અહેવાલ 1929માં આવ્યો, અને અલગ કરેલા માઇટોકોન્ડ્રિયા ઇલેક્ટ્રૉનનું સ્થાનાંતરણ કરતી વખતે ફૉસ્ફેટનું એસ્ટરીકરણ કરે છે તે 1949માં દર્શાવાયું. મિથિલીન બ્લુ અંગેના શરૂઆતના કોઈ પણ સંશોધનપત્રમાં ઊર્જાનું ઉત્પાદન માપી શકાયું ન હોત, અને કોઈએ એવો દાવો કર્યો પણ નહોતો.

બીજી સમસ્યા કોષોની છે. સસ્તન પ્રાણીઓના પરિપક્વ લાલ રક્તકોષોમાં માઇટોકોન્ડ્રિયા હોતાં નથી. રેટિક્યુલોસાઇટ અવસ્થા દરમિયાન તેઓ પસંદગીયુક્ત ઑટોફેજી દ્વારા માઇટોકોન્ડ્રિયા અને રાઇબોસોમ દૂર કરે છે. તેથી જ પરિપક્વ લાલ રક્તકોષ ગ્લાયકોલિસિસ પર ચાલે છે અને તેના પેન્ટોઝ ફૉસ્ફેટ માર્ગ પર મુખ્યત્વે ATPને બદલે NADPH માટે આધાર રાખે છે. 1928ના પ્રયોગોમાં સુધારવા માટે કોઈ ઇલેક્ટ્રૉન પરિવહન શૃંખલા હાજર જ નહોતી. ઑક્સિજન વાપરતી પ્રક્રિયા કંઈક બીજું કરી રહી હતી.

એ બીજી પ્રક્રિયા શું હતી તેનું હવે પ્રમાણમાં સારું વર્ણન ઉપલબ્ધ છે. મિથિલીન બ્લુ કોષમાં રહેલા અપચાયક સમકક્ષોમાંથી ઇલેક્ટ્રૉન સ્વીકારે છે અને લ્યુકોમિથિલીન બ્લુ બને છે; આણ્વિક ઑક્સિજન તેનું ફરી ઑક્સિડેશન કરે છે અને ચક્ર પૂરું થાય છે. માનવ લાલ રક્તકોષોમાં NADPH-આધારિત ફ્લેવિન રિડક્ટેઝ અને સંબંધિત ડાઇસલ્ફાઇડ રિડક્ટેઝ અપચયનું પગલું કરે છે. ચિહ્નિત ગ્લુકોઝનો ઉપયોગ કરતા 1976ના અભ્યાસમાં જણાયું કે રંગદ્રવ્ય હેક્સોઝ મોનોફૉસ્ફેટ શન્ટને ઉત્તેજિત કરે છે, ઓછી સાંદ્રતાની અસર ઑક્સિહીમોગ્લોબિન પર આધારિત હતી અને વધુ સાંદ્રતા, 0.1 mM, પર હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડ ઉત્પન્ન થતો હતો. અપચયિત રંગદ્રવ્ય ઑક્સિજનના સંપર્કમાં આવે ત્યારે પેરોક્સાઇડ બનાવે છે, ફૉસ્ફેટ બંધ નહીં.

માઇટોકોન્ડ્રિયામાં સ્થિતિ લોકપ્રિય સારાંશોમાં દર્શાવાય છે તેના કરતાં વધુ વિવાદાસ્પદ છે. સંશોધનની એક દિશા અનુસાર રંગદ્રવ્ય કૉમ્પ્લેક્સ Iના વિસ્તારમાંથી ઇલેક્ટ્રૉન લઈને સાઇટોક્રોમ cને આપે છે. બીજા સંશોધનમાં જણાયું કે ઉંદરના મગજના માઇટોકોન્ડ્રિયામાં તે એન્ટિમાઇસિનથી થયેલા અવરોધ પછી શ્વસન પુનઃસ્થાપિત કરી શકતું નથી, અને તેના બદલે ઇલેક્ટ્રૉન સ્વીકારકનું સ્થાન કૉમ્પ્લેક્સ IIIના યુબિક્વિનોલ-બંધન સ્થળે હોવાનું સૂચવાયું. ત્રીજા સંશોધનમાં જણાયું કે ઓછી સાંદ્રતાએ વિશ્રામાવસ્થાનો ઑક્સિજન વપરાશ વધાર્યો, જ્યારે ADPથી ઉત્તેજિત શ્વસન અપરિવર્તિત રહ્યું. આ મુદ્દાનું સૌથી સીધું નિવેદન એ છે કે મિથિલીન બ્લુથી પ્રેરિત ઑક્સિજનનો વપરાશ ઑક્સિડેટિવ ફૉસ્ફોરિલેશન પર જરાય આધારિત નથી: શ્વસન શૃંખલા અવરોધાયેલી હોય ત્યારે પણ તે ચાલુ રહ્યો, અને શૃંખલા વિનાની પ્રયોગાત્મક તૈયારીઓમાં પણ.

આ બે પરિમાણો વચ્ચેના તફાવતનાં સીધાં માપન પણ ઉપલબ્ધ છે. ઉંદરના યકૃતમાંથી અલગ કરેલા માઇટોકોન્ડ્રિયામાં રંગદ્રવ્યની વધતી સાંદ્રતાએ શ્વસન નિયંત્રણ ગુણોત્તરો ઘટાડ્યા અને સોજો ઉત્પન્ન કર્યો, જેને લેખકોએ ઑક્સિડેટિવ ફૉસ્ફોરિલેશનનું વિયુગ્મન ગણાવ્યું. પ્રવાહી પ્રવાહથી પરફ્યુઝ કરેલા ઉંદરના યકૃતમાં મિથિલીન બ્લુએ ઑક્સિજનનો વપરાશ વધાર્યો, જ્યારે ATP અને ADPનો ગુણોત્તર ઘટ્યો.

ક્લિનિકલ નોંધો પણ એ જ સંદેશ આપે છે. મેથેમોગ્લોબિનેમિયાની સારવાર NADPH-આધારિત અપચય માર્ગ દ્વારા પ્રતિ કિલોગ્રામ આશરે એકથી બે મિલિગ્રામ મિથિલીન બ્લુ નસમાં આપીને કરવામાં આવે છે, અને વધુ માત્રા એ જ સ્થિતિ ઉત્પન્ન કરે છે જેની સારવાર થઈ રહી હોય. એ જ સમીક્ષા નોંધે છે કે વિષપ્રતિકારક અસર અખંડ લાલ રક્તકોષોમાં સૌથી વધુ હોય છે અને હીમોલિસિસની હાજરીમાં ઘટે છે. આ 1930ના હીમોલિસિસ અંગેના તારણનું ત્રોતેર વર્ષ પછી હૉસ્પિટલના સંદર્ભમાં ફરી દેખાવું છે. જે સંયોજનની ઉપયોગી અને હાનિકારક અસરો માત્રાની એક મર્યાદાની વિરુદ્ધ બાજુઓ પર હોય, તેની માત્રા ઑક્સિજન વપરાશના માપન પરથી નક્કી કરવી ન જોઈએ.

આ ચર્ચામાં બૅચનો સમાવેશ શા માટે જરૂરી છે

હેરોપ અને બેરોને એવી બાબત નોંધી હતી જેને ફરી વાંચવા જેવી છે. મિથિલીન બ્લુ પોતે સ્પેક્ટ્રોસ્કોપમાં મેથેમોગ્લોબિનના બે વિશિષ્ટ પટ્ટાઓની વચ્ચે એક પટ્ટો ઉત્પન્ન કરે છે, “જે ઉપરછલ્લા નિરીક્ષણ વખતે સહેલાઈથી ગૂંચવણ પેદા કરી શકે છે.” જે પદાર્થ શોધાઈ રહ્યો હોય, રંગદ્રવ્ય તેના જેવું દેખાઈ શકે છે.

આ જ સમસ્યાનું રાસાયણિક સ્વરૂપ પણ છે. ગૌણ ઘટક તરીકે હાજર સંબંધિત ફીનોથાયાઝિનનું પોતાનું રેડૉક્સ વર્તન, પોતાની પારગમ્યતા અને પોતાનું ઝેરીપણું હોય છે. એક દસ્તાવેજીકૃત ઉદાહરણ આ મુદ્દાનું મહત્વ સ્પષ્ટ કરે છે: મિથિલીન બ્લુના આયોડિનેશનના અભ્યાસમાં આશરે 7થી 8 ટકા Azure B ધરાવતા નમૂનાઓએ મુખ્યત્વે આયોડિનેટેડ Azure B ઉત્પન્ન કર્યું. એટલે મિથિલીન બ્લુને બદલે અશુદ્ધિએ પ્રતિક્રિયામાં પ્રભુત્વ જમાવ્યું.

પ્રયોગશાળામાં, સ્ટેઇનિંગ બેન્ચ પર અથવા ઍક્વેરિયમમાં મિથિલીન બ્લુને અભિકર્મક તરીકે વાપરનાર કોઈ પણ વ્યક્તિ, જ્યાં સુધી બૅચનું લાક્ષણીકરણ થયું ન હોય ત્યાં સુધી, અસ્પષ્ટ ઘટક સાથે કામ કરે છે. સંબંધિત પદાર્થો, ઓળખ, તત્ત્વીય અશુદ્ધિઓ, અવશેષ દ્રાવકો અને પ્રજ્વલન પછીનો અવશેષ એ પ્રયોગનો જ ભાગ છે, તેની આસપાસની કાગળની કાર્યવાહી નહીં. Blupreme તેનું મિથિલીન બ્લુ એક ફાર્માસ્યુટિકલ ઉત્પાદક પાસેથી મેળવે છે અને વિશ્લેષણનું સંપૂર્ણ પ્રમાણપત્ર પ્રકાશિત કરે છે. તેમાં માત્ર ભારે ધાતુઓને બદલે સમગ્ર USP વિનિર્દેશનું પરીક્ષણ થાય છે; વિશ્લેષણનું પ્રમાણપત્ર વાંચવાની માર્ગદર્શિકા અને USP-ગ્રેડ ઓળખ શું સ્થાપિત કરે છે અને શું નથી કરતી એ દાવાની સામે દસ્તાવેજ કેવી રીતે ચકાસવો તે સમજાવે છે.

આંકડો સાચો હતો

1928 અને 1930ના પ્રયોગો કાળજીપૂર્વક કરાયા હતા, અને તેમનું મુખ્ય નિરીક્ષણ આજે પણ માન્ય છે: અપચય પામી શકે એવું રંગદ્રવ્ય, ભાગ્યે જ શ્વસન કરતા કોષને તેના વિશ્રામાવસ્થાના દર કરતાં અનેકગણો ઑક્સિજન વાપરવા પ્રેરિત કરી શકે છે, અને તે પણ સાયનાઇડ જે પગલું અવરોધે છે તેમાંથી પસાર થયા વિના.

ભૂલ પછી થાય છે, જ્યારે “શ્વસન”ને તેના આધુનિક અર્થમાં વાંચવામાં આવે છે. ગૅસ-વિનિમયનું માપન તમને જણાવે છે કે ઇલેક્ટ્રૉન ઑક્સિજન સુધી પહોંચ્યા. તે તમને એવું નથી જણાવતું કે તેમાંના કોઈનો ઉપયોગ ATP બનાવવા માટે થયો હતો, અને માઇટોકોન્ડ્રિયા વિનાના કોષમાં આ બે નિવેદનો વચ્ચેનો તફાવત શક્ય તેટલો મોટો છે. મિથિલીન બ્લુ કોષોમાં શું કરે છે તેનો વ્યાપક નકશો આ જ ભેદને વધુ વિશાળ સંદર્ભમાં મૂકે છે, અને રંગદ્રવ્યથી દવા સુધીનો આ સંયોજનનો ઇતિહાસ સમજાવે છે કે કાપડને રંગ આપતો પદાર્થ આ પ્રયોગો સુધી પહોંચ્યો જ કેવી રીતે.