Artigo
Quen desenvolveu a tinguidura púrpura do sangue? Azul de metileno, Malachowski, Romanowsky e Giemsa
A eosina é vermella. O azul de metileno é azul. Mestúranse os dous, aplícase a mestura a un frotis de sangue seco e algunhas partes do frotis quedan púrpuras.
Non todas. Nunha boa preparación, os núcleos dos glóbulos brancos adquiren unha cor vermella púrpura e, dentro dun parasito da malaria, a cromatina toma a mesma cor, mentres que os glóbulos vermellos circundantes permanecen rosados e o citoplasma queda azul agrisado. A cor púrpura é o que permite distinguir os tipos celulares.
Ningún dos dous frascos contén púrpura. A cor aparece só cando un produto concreto da degradación do azul de metileno entra en contacto coa eosina no portaobxectos, e nas décadas de 1880 e 1890 ninguén sabía que ese produto existía, e moito menos que era. Quen buscaba esa cor traballaba con colorantes impuros, en solitario, sen ningún método fiable para saber que había nun frasco despois de pasar dous meses nun andel.
Por iso a pregunta do título ten máis dunha resposta defendible, e por iso a resposta cambiou en 2011.
Un resultado que cambiaba coa mestura
A tinguidura non se inventou. Foi o resultado de achegas sucesivas. Cada cambio na mestura proporcionou exactamente un novo elemento de información visible, e a secuencia deses elementos é a forma máis clara de entender a historia.
| Ano | Que había no recipiente | Que se podía ver |
|---|---|---|
| 1865 | Ácido pícrico, o primeiro colorante sintético aplicado ao sangue, por Wilhelm Erb | Un patrón de encaixe dentro dalgúns glóbulos vermellos. |
| 1876 | Azul de metileno, por Heinrich Caro e Adolf von Baeyer en BASF | Bacilos da tuberculose, nas mans de Robert Koch. Células sanguíneas nun único ton azul. |
| 1880 | Azul de metileno con fucsina ácida, a tinguidura neutra de Ehrlich | Glóbulos vermellos e gránulos dos eosinófilos vermellos, núcleos de azul intenso, citoplasma dos linfocitos de azul pálido e gránulos violeta escuro que captaban ambos os colorantes. Por iso a célula se chama neutrófilo. O primeiro reconto diferencial de glóbulos brancos. |
| 1888 | Azul de metileno con eosina. Czesław Chęciński | O propio parasito: formas azuis con aspecto de margarida (Plasmodium malariae) e formas de fouce (gametocitos de P. falciparum). Non o seu núcleo. |
| 1890 | Máis azul de metileno, menos alcohol e hidróxido de potasio. Albert Plehn | Unha gama de cores máis ampla e intensa, con glóbulos vermellos e gránulos dos eosinófilos de cor rosa. Aínda só vermello e azul. |
| 1890 | Eosina con azul de metileno alcalinizado con bórax. Ernst Malachowski | Cromatina vermella púrpura dentro do parasito, co núcleo distinguible do citoplasma. De forma deliberada e, segundo o seu relato, reproducible. |
| 1891 | Eosina con azul de metileno dun frasco con mofo de máis de dous meses. Dmitri Romanowsky | A mesma cor púrpura, unha vez, mediante un método que outros non podían repetir. |
| 1898 a 1902 | Colorante policromado extraído con cloroformo (Nocht); metanol (Jenner); redisolución alcohólica do precipitado (Leishman, Reuter, Wright); cantidades medidas de colorantes con glicerol (Giemsa) | A cor púrpura cando se precisaba, nun produto que se comportaba do mesmo xeito no seguinte laboratorio. A versión de Jenner, sen colorante policromado, non daba púrpura. |
| 1940 a 1943 | Lillie, Roe e Wilcox separaron os compoñentes e probáronos un a un | Azure B, non a mestura, é o compoñente que produce a cor púrpura. |
O patrón da última columna é o importante. Cada avance ampliou a gama de cores, e cada ampliación fixo visible unha estrutura máis. A cor púrpura non é un adorno da técnica; é a diferenza entre ver que hai un parasito e ver de que está composto. Como o propio colorante saíu dunha fábrica de colorantes de BASF e chegou á medicina é unha historia máis longa coa súa propia documentación. A secuencia completa anterior, coa fonte de cada entrada, consérvase nunha cronoloxía de contribuidores con ligazóns ás fontes.
Figura: as mesmas seis mesturas representadas segundo o que había no recipiente e o que se obtivo del. Os círculos conteñen os colorantes; os bloques de debaixo conteñen as cores que eses colorantes podían producir nun frotis de sangue. Ningunha mestura anterior a 1890 presenta un bloque vermello púrpura, e ningunha posterior o omite.
O home que usou bórax a propósito
Ernst Malachowski era un médico de Breslau, hoxe Wrocław, que pasou a súa carreira na consulta privada e nunha pequena clínica que dirixía cun colega, facendo traballo de laboratorio no seu tempo libre. Naceu en Strzelno o 12 de marzo de 1857, estudou medicina na Universidade de Breslau e traballou de 1882 a 1887 como asistente de medicina interna no Hospital de Todos os Santos, daquela o segundo hospital máis grande de Alemaña.
Comezou en 1888 coa tinguidura dobre de Chęciński e Plehn. Nunha preparación feita en 1889 viu que a cromatina do núcleo do plasmodio se tinguía de maneira distinta ao citoplasma, e despois comprobou que non podía reproducilo. Probou a acidificar o azul de metileno, o que empeorou as cousas. Probou a alcalinizalo con bórax, o que funcionou todas as veces. Demostrou o método publicamente o 15 de xuño de 1890 e publicou unha descrición máis completa en agosto de 1891, incluída a instrución de usar bórax. Sinalou que a tinguidura levaba vinte e catro horas e que os resultados eran facilmente reproducibles.
Vinte e catro horas é moito tempo nun laboratorio de diagnóstico, e o seu artigo non se detiña na cor púrpura vermella do núcleo do parasito. Fose cal fose a razón, ninguén retomou a alcalinización deliberada do azul de metileno ata que Nocht a volveu facer en 1898. Malachowski nunca volveu escribir sobre a tinguidura do sangue.
A razón pola que se sabía tan pouco del ata hai pouco ten que ver cos arquivos, non con ningún misterio. Case non sobreviviu rastro da súa vida na literatura médica, e o que sobreviviu chegou por unha única vía. A súa filla Marie marchou de Alemaña a Londres en 1939, serviu no exército británico e estableceuse no Canadá, e a súa colección de documentos familiares acabou no Instituto Leo Baeck de Nova York. O seu irmán Leo morreu na Primeira Guerra Mundial. A súa irmá Eva foi deportada de Breslau ao campo de tránsito de Izbica en abril de 1942 e nunca regresou. A súa nai Hedwig quitouse a vida o 22 de abril de 1942 en vez de agardar pola mesma deportación. Malachowski morrera en 1934, antes de todo iso.
Unha historia familiar que remata así é unha historia familiar que deixa de citarse. Os dous artigos que devolveron a Malachowski á historia do desenvolvemento da tinguidura, ambos publicados en 2011, elaboráronse a partir de documentos de arquivo de Poznań e Wrocław e dos documentos de Marie en Nova York.
Un frasco con mofo e un ruso con sorte
Dmitri Romanowsky estudou medicina na Academia Médica Militar de San Petersburgo e traballou sobre a malaria durante a maior parte da súa carreira. En 1890 publicou un método que, sobre o papel, era case idéntico ao de Chęciński: azul de metileno sen modificar e eosina, cun pouco máis de eosina.
En setembro de 1891 publicou o método que lle deu sona, e o detalle decisivo estaba agochado nas instrucións. Os seus mellores resultados procedían da solución de metileno en reserva, unha solución de reserva de azul de metileno que levaba máis de dous meses repousando e na que medrara mofo. O mofo e o tempo de repouso desmetilaran parcialmente o colorante. Romanowsky non o sabía nin podía controlalo, e outros investigadores que probaron o seu método non lograron obter a cor púrpura. Presentara a súa tese en San Petersburgo en xuño de 1891, polo que o relato habitual considera 1891 o ano do descubrimento.
A demostración de Malachowski fora en xuño de 1890, máis dun ano antes, e o seu método funcionaba de forma deliberada.
Por que o epónimo lle correspondeu ao home equivocado
Kristine Krafts, Ernst Hempelmann e Barbara Oleksyn reuniron os argumentos a favor de Malachowski, que se apoian en catro puntos. A data da demostración pública: xuño de 1890 fronte a setembro de 1891. A palabra deliberado fronte á palabra fortuíto. O feito de que Malachowski publicase o seu método, bórax incluído, mentres que o de Romanowsky dependía dunha variable non controlada. E a observación de que a descrición do núcleo do plasmodio, xunto coa cor púrpura que o revelaba, practicamente desapareceu da literatura durante sete anos, porque ninguén podía reproducir a versión accidental.
Son contundentes na conclusión. No artigo biográfico cualifican a atribución de «un despropósito» e citan a Ralph Lillie, que en 1978 escribiu que «quizais deberiamos referirnos a esta familia de tinguiduras como tinguiduras de Malachowski».
A reivindicación é discutida, como adoita ocorrer coas reivindicacións de prioridade, e paga a pena explicar os termos da disputa en vez de resolvela. Un argumento sobre a prioridade debe precisar en que consistiu o descubrimento. Se o descubrimento é a cor púrpura, Malachowski ten a demostración documentada máis antiga. Se o descubrimento é o método publicado, ambos publicaron en 1891 e o epónimo correspondeulle a Romanowsky. Se o descubrimento é a explicación, ningún dos dous pode reivindicalo, porque ningún sabía que a maduración era unha desmetilación e ningún podía explicar por que aparecía a cor. Ese último punto é o que omiten os relatos divulgativos. O ingrediente activo era unha impureza que ninguén identificara, e a primeira persoa que produciu a cor deliberadamente fíxoo cunha receita empírica reproducible, non comprendendo o que facía a receita.
Os dous artigos de 2011 son a exposición publicada máis completa dos argumentos a favor de Malachowski, e ambos poden lerse de balde en PubMed: a revisión extensa en PMID 21235291 e o artigo biográfico en PMID 21660627. O rexistro da revisión en PubMed tamén recolle un comentario sobre ela, publicado na mesma revista máis adiante ese ano en 86(5):366, o que lembra oportunamente que o argumento foi cuestionado por escrito en canto apareceu.
A disputa non é un desacordo sobre química. Todas as persoas implicadas coinciden en que é a cor púrpura e que compoñentes a producen. O desacordo é sobre quen chegou primeiro e sobre se un accidente que ninguén podía repetir conta sequera como ter chegado.
Que achegaron os nomes posteriores
Se Malachowski produciu a cor púrpura primeiro, por que a tinguidura leva os nomes de Romanowsky, Wright e Giemsa?
Porque unha tinguidura que funciona unha vez nas mans do seu inventor non é un reactivo. O traballo posterior converteu unha mestura caprichosa en algo que un técnico doutro país podía usar un martes.
Nocht chegou a ela mediante o razoamento. Tras non conseguir un resultado fiable cun simple colorante neutro, concluíu que a cor púrpura debía proceder de algo presente no azul de metileno que non era azul de metileno, e púxose a buscalo. Unna xa observara que as solucións envellecidas de azul de metileno tinguían de vermello os gránulos dos mastocitos, e propuxera que se formaba unha substancia nova ao madurar o colorante. Bernthsen demostrara en 1885 que as condicións alcalinas eliminan grupos metilo do azul de metileno, e que eses produtos son o que hoxe chamamos azures. Nocht extraeu a fracción activa con cloroformo e só puido chamala vermello a partir do azul de metileno; Michaelis deulle o nome de azur I en 1901. Jenner resolveu a loxística. Redisolver o precipitado de azul de metileno e eosina en metanol absoluto daba unha única solución estable que fixaba o frotis ao tempo que o tinguía e eliminaba a necesidade de fixación por calor. Leishman e Reuter combinaron colorante policromado cun disolvente alcohólico e conseguiron estabilidade e cor púrpura á vez. Wright substituíu unha incubación de doce horas a 65 °C e dez días de repouso por unha hora nun fluxo de vapor. Giemsa deixou por completo de depender dunha solución madurada ao azar e empregou cantidades medidas de colorantes coñecidos con glicerol no metanol para que o produto resistise a calor tropical. Nunca publicou como preparaba o azur de metileno puro. Vendeuno ao laboratorio do Dr. Grübler en Leipzig, que o comercializou como azur I e afirmou que só a súa versión era a auténtica tinguidura de Giemsa.
A identidade dese azur segue sendo motivo de debate. Algúns sosteñen que era simplemente azul de metileno policromado; outros, que era rico en azure B. A resposta xurdiu dunha guerra. Cando deixou de ser posible obter colorantes alemáns, un equipo do Servizo de Saúde Pública dos Estados Unidos, formado por Ralph Lillie, Maurice Roe e Aimee Wilcox, descubriu que a mellor tinguidura se obtiña con tres compoñentes separados: azul de metileno sen modificar, o seu produto de degradación desmetilado azure B e eosina. Azure B substituíu o azur I que non se podía obter, e eses tres compoñentes seguen sendo a base da tinguidura que se usa hoxe para diagnosticar a malaria.
A química de como interactúan eses tres compoñentes nun portaobxectos é unha cuestión distinta e corresponde a outra páxina. A páxina sobre as funcións dos colorantes e a química das tinguiduras de tipo Romanowsky explica que fan o azure B e a eosina e por que a parella produce unha cor que ningún dos dous produce por separado. A páxina de microscopía e aplicacións de laboratorio trata o aspecto práctico: que mostra unha preparación determinada e como avaliar se un produto concreto é axeitado para o método que se pretende usar.
A parte da historia que segue vixente
Un detalle desta historia non deixou de ser certo en 1902. Durante aproximadamente cincuenta anos, o compoñente máis importante da tinguidura estándar para a malaria en todo o mundo foi unha impureza sen nome. Estaba alí por accidente, a súa cantidade variaba entre frascos, a súa identidade foi un segredo comercial durante parte dese tempo e a súa proporción foi motivo de debate ata a década de 1940. Quen usaba a tinguidura non era descoidado. Non tiña maneira de saber que había no frasco.
A versión moderna do mesmo problema é unha especificación que describe só unha parte do material. A conformidade coa USP é a vía cara á maior pureza que ofrece o mercado, porque é unha norma publicada completa e non unha única medición: identidade, pureza, impurezas orgánicas incluídos os colorantes azur, disolventes residuais, impurezas elementais, residuo de ignición, límites microbianos e endotoxinas bacterianas. Blupreme obtén o seu azul de metileno dun fabricante farmacéutico e publica o certificado de análise completo, de modo que cada elemento desa lista se poida comprobar en vez de simplemente afirmarse. Un certificado que informa dun resultado de metais pesados e o chama conformidade coa USP é o equivalente actual dun frasco etiquetado como «azul de metileno madurado»: posiblemente un bo reactivo, pero a etiqueta non di que contén.