Proba de redución do azul de metileno no líquido ruminal

Unha veterinaria acabada de graduar chama desde unha granxa cun tubo azul na man. Engadiu azul de metileno ao líquido ruminal hai dez minutos e a cor azul segue aí. Pregunta se debería darlle máis colorante á vaca.

Esa pregunta revela unha concepción errónea. Na proba de redución do azul de metileno no líquido ruminal, o colorante vai no tubo, nunca no animal. O tubo contén todo o ensaio. Cronometrar a rapidez coa que desaparece a cor azul achega información sobre os microbios desa mostra, non sobre un tratamento que o animal necesite.

A confusión é comprensible porque o azul de metileno aparece en tres contextos veterinarios distintos. Este artigo sepáraos e explica como interpretar o tempo de redución xunto co pH, os protozoos, a calidade da mostraxe e os signos clínicos.

Que mide realmente a proba

O azul de metileno é azul cando está oxidado e case incoloro cando está reducido. O líquido ruminal fresco dun animal san ten unha forte capacidade redutora porque as bacterias anaerobias están a fermentar activamente o alimento. Ao mesturar unha pequena cantidade de colorante con ese líquido, o metabolismo bacteriano elimina a cor en poucos minutos.

Así, o principio de funcionamento é sinxelo: a flora anaerobia activa elimina a cor azul rapidamente; a flora inactiva ou danada elimínaa lentamente. Un tempo curto significa unha maior capacidade redutora nesa mostra. Un tempo prolongado apunta a unha actividade microbiana diminuída, sempre que a mostra se recollese e manipulase correctamente.

Non mide directamente o potencial redox do rume. Un estudo de métodos en gando bovino que comparou a proba de redución con medicións directas en milivoltios non atopou unha correlación lineal entre o tempo de redución e o potencial redox medido, e concluíu que non deben tratarse como lecturas intercambiables da mesma variable. A comparación completa está resumida en PubMed. Considere a proba de redución como un ensaio funcional da poboación microbiana, non como un eléctrodo barato.

A descrición de Merck/MSD da indixestión simple nos ruminantes sitúa o tempo de redución prolongado no mesmo patrón ca un pH ruminal anormal e un número reducido de protozoos. Ningún valor illado establece o diagnóstico. O patrón si.

Un procedemento estándar á beira do animal

Os protocolos varían lixeiramente entre centros de ensino, polo que debe rexistrar os volumes exactos e a temperatura que utiliza e comparar os resultados só dentro dese protocolo. Unha versión que se ensina amplamente é a seguinte:

Recolla polo menos entre 10 e 20 mL de líquido ruminal fresco, coa mínima cantidade de saliva, exposición ao aire e arrefriamento posibles. Faga a proba de inmediato.
Prepare azul de metileno ao 0.03 por cento, equivalente a 0.3 mg por mL.
Engada colorante nunha cantidade equivalente ao 5 por cento do volume de líquido. É dicir, 1.0 mL de colorante por 20 mL de líquido, ou 0.5 mL de colorante por 10 mL de líquido. Ambas as opcións dan a mesma proporción de líquido e colorante de 20 a 1.
Reserve un segundo tubo de líquido sen tratar da mesma mostra como control de cor.
Mesture suavemente, poña o cronómetro en marcha de inmediato e manteña o tubo preto da temperatura corporal, arredor de 37 a 39 graos Celsius segundo o protocolo local.
Rexistre o tempo ata que a cor do tubo de ensaio coincida coa do control. Pode persistir un fino anel azul na superficie en contacto co aire porque o osíxeno reoxida alí o colorante. Non espere a que desapareza ese anel.

A química redox do azul de metileno explica por que o osíxeno importa neste caso. Unha axitación vigorosa, un tubo cunha abertura ampla ou unha demora prolongada permiten a entrada de osíxeno e manteñen o colorante azul máis tempo do que o faría o propio rume. Os detalles dunha técnica de recollida de líquido ruminal sen contaminación importan polo mesmo motivo. A saliva dilúe a mostra e eleva o pH, polo que, ao empregar unha sonda gástrica, moitos veterinarios descartan a primeira porción cando o volume o permite.

Que miden as distintas observacións

O tempo de redución responde a unha única pregunta. A avaliación ruminal que aparece a continuación mostra que achega cada observación realizada á beira do animal. Utilice a fila completa, non unha soa cela.

Observación	Que mide	Achado habitual á beira do animal	Factores de confusión frecuentes
Tempo de redución do azul de metileno	Actividade redutora funcional das bacterias anaerobias da mostra	En bovinos, a miúdo entre 2 e 6 minutos; en ovinos e caprinos adoita ser máis rápida, con 6 minutos como límite práctico para unha actividade adecuada e tempos superiores a 10 minutos claramente anormais	Mostra fría, analizada con demora, aireada ou diluída con saliva; pouco substrato tras unha anorexia prolongada; antimicrobianos orais; comparación entre distintas proporcións de colorante ou temperaturas
pH ruminal	Medio químico, carga ácida ou alcalina	En bovinos alimentados con forraxe, a miúdo preto de 6.0 a 7.2; os textos sobre pequenos ruminantes adoitan citar arredor de 6.5 a 7.5; a dieta e o tempo transcorrido desde a alimentación modifican o valor	A contaminación con saliva eleva o pH nas mostras obtidas por sonda gástrica; perda de dióxido de carbono tras a recollida; a alimentación con cereais reduce o pH
Número e motilidade dos protozoos	Integridade da poboación de ciliados, especialmente das formas grandes sensibles ás alteracións	Numerosos organismos de varios tamaños con movemento direccional vigoroso nunha gota fresca e morna	O arrefriamento ralentiza o movemento; a acidose grave pode eliminar os protozoos; a demora fai que unha mostra normal pareza pouco activa
Olor, cor e consistencia	Características da fermentación e contaminación	Líquido lixeiramente aromático, pardo verdoso e algo viscoso	Olor pútrido ou agrio con disbiose grave; líquido acuoso ou con moita saliva tras unha recollida deficiente
Contraccións ruminais e apetito	Función dos preestómagos e inxestión no conxunto do animal	Contraccións regulares e ruminación constante nun animal alerta	Cambio recente da ración, dor, deshidratación, enfermidade sistémica

A clave está na táboa. Un tempo de redución prolongado xunto con protozoos pouco activos, pH anormal e contraccións débiles apunta a unha diminución real da actividade microbiana. Un tempo prolongado illado nun animal alerta, que rumina e presenta protozoos vigorosos, apunta á mostra, non ao rume. Repita a recollida antes de actuar.

Interpretar o tempo co pH e os antecedentes

A dieta establece o valor de referencia. As racións ricas en concentrados fermentan rapidamente e poden eliminar a cor do colorante en aproximadamente un minuto, mentres que as dietas de feo poden tardar varios minutos, mesmo en animais sans. Polo tanto, un tempo curto non demostra por si só un mellor estado de saúde. Demostra que unha maior cantidade de substrato fermentable entrou en contacto con microbios activos.

Unha sobrecarga grave de cereais rompe esa tendencia sinxela. A fermentación inicial dos hidratos de carbono pode ser intensa; despois, o dano causado pola acidez inhibe a flora normal e os protozoos, e a redución prolóngase. Por iso, unha regra que se ensina establece que a proba non é válida cando o pH ruminal está por debaixo de aproximadamente 5.5. Nese punto, a flora que se está a analizar xa cambiou.

Unha guía práctica de patróns:

Un pH normal cunha redución en aproximadamente 6 minutos suxire unha flora funcionalmente activa.
Un pH normal cunha redución claramente prolongada suxire inactividade por anorexia, efecto antimicrobiano ou unha mostra comprometida.
Un pH elevado cunha redución prolongada adoita aparecer tras unha anorexia prolongada con pouco substrato, pero cómpre considerar a contaminación con saliva procedente da sonda.
Un pH baixo cunha actividade protozoaria reducida fai sospeitar unha disbiose relacionada cos hidratos de carbono. As orientacións para interpretar o pH ruminal axudan neste caso. Os valores inferiores a 5.5 con decaemento sistémico apuntan máis a unha sobrecarga de cereais e a unha acidose grave que a unha indixestión simple.

Rexistre sempre o uso recente de tetraciclinas orais, ionóforos no alimento, tratamentos prolongados con antimicrobianos sistémicos, cambios bruscos de ración, duración da anorexia e inxestión de auga. O manual MSD advirte especificamente de que as tetraciclinas orais poden diminuír de forma considerable a actividade da microflora ruminal. Os ionóforos modifican intencionadamente as poboacións bacterianas. Sen eses antecedentes, un tempo prolongado non se pode interpretar.

A calidade da mostraxe merece o mesmo peso. Un estudo controlado atopou que as mostras obtidas por sonda gástrica tiñan un pH máis alto e menos ácidos graxos volátiles ca as mostras obtidas por cánula dos mesmos animais, en gran parte pola saliva. Aos 60 minutos da recollida, o tempo de redución prolongouse significativamente en todos os volumes analizados, e as mostras pequenas foron as máis afectadas. Recolla polo menos 10 mL, analice a mostra dentro dos 30 minutos seguintes, realice a proba de redución ao inicio, manteña a mostra morna e reduza ao mínimo o contacto co aire.

Tres usos que non deben confundirse

O mesmo colorante, tres sistemas distintos.

Primeiro, o ensaio de líquido ruminal descrito aquí. A mostra é líquido ruminal recollido. O colorante engádese in vitro ao 0.03 por cento. O criterio de valoración é o tempo ata a descoloración. A finalidade é avaliar a actividade redutora microbiana.

Segundo, o azul de metileno administrado a un ruminante vivo. O exemplo establecido é o tratamento intravenoso da intoxicación por nitratos ou nitritos con metahemoglobinemia, no que o fármaco restaura a hemoglobina funcional. Aplícanse normas sobre a dose, a formulación, os residuos e os tempos de espera. Esa decisión non ten nada que ver con cronometrar un tubo. Se o colorante se utiliza como trazador in vivo nun procedemento específico, o principio é observar por onde se despraza o colorante, non a rapidez coa que o reducen os microbios do rume.

Terceiro, a proba de redución do leite. A mostra é leite. O colorante engádese á mostra de leite. A perda rápida da cor azul indica xeralmente unha maior actividade microbiana e unha peor capacidade de conservación, mentres que unha redución lenta indica mellor calidade. Pertence á microbioloxía alimentaria e ás probas de calidade do leite, non á medicina ruminal, e non é un reconto bacteriano.

Empregar nomes explícitos evita erros: tempo de redución do líquido ruminal, tratamento sistémico con azul de metileno ou uso como trazador, e proba de redución do leite. A regra de seguridade cabe nunha frase. O colorante para o ensaio ruminal queda no tubo de laboratorio e ese tubo descártase. Nunca se administra ao animal para realizar a proba.

Unha regra breve para a chamada desde a granxa

Estandarice o colorante ao 0.03 por cento e a proporción en 1 parte de colorante por 20 partes de líquido, analice líquido fresco preto da temperatura corporal comparándoo cun control sen tratar e interprete os minutos xunto co pH, a motilidade dos protozoos, a calidade da recollida, a dieta, os fármacos, as contraccións, o apetito, as feces e a hidratación. Un número illado nunca diagnostica unha indixestión. Un patrón concordante si.