Artigo
Interpretación do aspecto das colonias de E. coli e doutros organismos en agar EMB
Un estudante sementa por estrías unha mostra descoñecida en agar de eosina e azul de metileno, incúbaa durante a noite e volve atopar unha placa con colonias escuras cun brillo verde. A anotación no caderno di «E. coli, confirmada». Esa anotación afirma máis do que a placa permite soster. A placa mostra un fenotipo de crecemento e fermentación nunhas condicións específicas. A identidade da especie é unha afirmación distinta que require probas independentes.
Esta guía aborda os resultados en agar EMB como unha tarefa de interpretación. Explica o principio subxacente, percorre un atlas ilustrativo de placas con controis e sinala os casos nos que a imaxe dos libros de texto pode inducir a erro.
O principio detrás da placa
O agar EMB é á vez selectivo e diferencial. Os colorantes eosina Y e azul de metileno inhiben moitos organismos grampositivos, polo que o medio favorece o crecemento dos gramnegativos. Os mesmos colorantes actúan como indicadores: cando un organismo fermenta o azucre dispoñible e produce suficiente ácido localmente, a colonia incorpora unha gran cantidade de colorante e adquire unha cor de púrpura escura a negro azulado. Cunha produción intensa de ácido, a superficie da colonia pode mostrar unha iridescencia verde metálica. O protocolo da ASM para placas de agar de eosina e azul de metileno describe esta combinación de selección e diferenciación e achega fotografías de referencia para a docencia.
Hai un detalle importante antes de interpretar calquera resultado: comproba que formulación se está a usar. A formulación máis antiga de Holt Harris Teague contén lactosa e sacarosa, mentres que o EMB de Levine só contén lactosa. Un organismo que fermenta a sacarosa pero non a lactosa, como moitos illados de Serratia marcescens, pode ter un aspecto diferente nas dúas versións. A documentación do fabricante sobre os medios EMB indica expresamente esta diferenza de formulación. Anota o fabricante e a formulación no caderno xunto co resultado.
O agar EMB preparado e sen inocular adoita ter unha cor de marrón avermellada a púrpura avermellada, ás veces cun ton verdoso ou un precipitado fino. Esa cor de fondo non é crecemento. Compara cada lectura cunha placa sen inocular ou co aspecto basal documentado, e fai a lectura da placa primaria tras unhas 18 a 24 horas de incubación aerobia a 35 a 37 C, salvo que o protocolo docente indique outra cousa. Unha incubación prolongada pode cambiar o aspecto da fermentación.
Como observar a placa
Usa dous tipos de luz. Primeiro inspecciona a placa con luz reflectida ou oblicua e inclínaa: o brillo metálico é iridescente e pode aparecer ou desaparecer segundo o ángulo de observación. Despois examínaa con luz transmitida para valorar a cor das colonias e os centros escuros. Traballa con colonias ben illadas, xa que a aglomeración e as colonias veciñas modifican a acumulación local de ácido e poden atenuar ou intensificar a cor. O conxunto de imaxes da ASM demostra isto directamente: E. coli nun cultivo mixto pode perder o brillo esperado porque os organismos do seu contorno alteran as condicións de acidez.
Inclúe controis sempre que o exercicio o permita. Un conxunto habitual na docencia é E. coli ATCC 25922 para o fenotipo negro azulado con brillo metálico, un organismo non fermentador como Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ou Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 para o fenotipo incoloro, e un grampositivo como Enterococcus faecalis ou Staphylococcus aureus como control de inhibición, tal como se recolle nas táboas estándar de control de calidade para medios EMB. Se o control positivo carece de brillo, sospeita primeiro da incubación, da aglomeración ou da formulación antes de sospeitar da mostra descoñecida.
Atlas ilustrativo de placas
As placas seguintes son ilustracións xeradas, non fotografías de cultivos reais. Mostran o patrón que se debe buscar, non o ton exacto dunha cepa concreta. Compáraas coas fotografías de referencia da ASM e con placas reais do laboratorio docente.
Placa 1: Escherichia coli en agar EMB, fermentador intenso da lactosa
E. coli en agar EMB adoita ter unha cor de púrpura escura a negro azulado, a miúdo cun centro escuro e un brillo verde metálico debido á produción intensa de ácido. O brillo é o famoso achado que buscan os estudantes, pero debe tratarse como unha proba de apoio e non como unha definición. A intensidade do brillo varía coa cepa, o tempo de incubación, a densidade das colonias e o ángulo de observación. A ausencia de brillo non exclúe E. coli, e unha colonia escura sen brillo apunta a varios outros organismos fermentadores. Escolle unha colonia ben illada para calquera traballo posterior, en lugar de interpretar un sector con colonias aglomeradas.
Placa 2: Klebsiella pneumoniae en agar EMB, fermentador mucoide
Klebsiella pneumoniae en agar EMB adoita formar colonias grandes, relucentes e mucoides, con tons de rosa púrpura a marrón púrpura, a miúdo con centros escuros pero normalmente sen un brillo metálico intenso. Os organismos fermentadores relacionados, como Enterobacter, presentan unha morfoloxía similar. A textura mucoide e o tamaño da colonia forman parte da interpretación: unha colonia rosada pequena e plana ten un peso diferente ao dunha grande, abovedada e mucoide. Como ocorre con E. coli, a placa suxire un fenotipo de fermentación, e a identificación a nivel de especie require a confirmación bioquímica descrita máis abaixo.
Placa 3: Salmonella en agar EMB e outros organismos non fermentadores, colonias incoloras
Salmonella en agar EMB e outros organismos relacionados que non fermentan a lactosa, incluídos Shigella e moitos illados de Pseudomonas, adoitan crecer como colonias incoloras, translúcidas ou de cor ámbar pálida. Algunhas formulacións e condicións dan un leve ton rosado, polo que unha colonia rosa pálida non é automaticamente fermentadora. O EMB non distingue Salmonella de Shigella nin doutros organismos non fermentadores; esa distinción corresponde a probas posteriores. Ten en conta tamén que se documentaron cepas de Salmonella positivas para a lactosa con colonias metálicas similares ás de E. coli, o que constitúe outro motivo polo que unha soa placa non pode pechar o caso.
Placa 4: Serratia marcescens e a trampa da formulación
Serratia marcescens merece unha sección propia porque os estudantes adoitan esperar colonias vermellas e logo interpretan mal a placa. A maioría dos illados clínicos non fermentan a lactosa, polo que en EMB de Levine adoitan aparecer pálidos ou pouco coloreados. Como moitos illados fermentan a sacarosa, unha formulación que conteña sacarosa pode dar unha reacción máis escura ou máis asociada á produción de ácido. Tampouco esperes o clásico pigmento vermello prodixiosina a 35 a 37 C; a produción de pigmento non é fiable á temperatura de incubación. Cando o protocolo mencione Serratia marcescens en agar EMB, comproba que formulación dá por suposta esa afirmación. Unha revisión do metabolismo de Serratia resume o patrón negativo para a lactosa e variable para a sacarosa que explica esta trampa.
Placa 5: controis e organismos inhibidos
Os organismos grampositivos como Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus e Bacillus adoitan quedar inhibidos ou presentar un crecemento moi reducido en agar EMB, aínda que a inhibición non é absoluta para todas as cepas. Un panel de controis permite unha interpretación rigorosa: o control de E. coli debería mostrar un bo crecemento con cor negra azulada e brillo, o control do organismo non fermentador debería mostrar crecemento incoloro, e o control de inhibición debería mostrar pouco ou ningún crecemento. Se o control de inhibición medra ben, fallou a etapa selectiva e toda outra lectura dese lote resulta dubidosa. Os métodos de tinguidura responden a unha pregunta diferente da dos medios de cultivo; para a vertente do laboratorio dedicada á tinguidura de preparacións en portaobxectos, consulta o atlas de tinguidura con azul de metileno.
Comparación cos seus límites
| Observación en agar EMB | Significado probable | O que non establece |
|---|---|---|
| Colonia escura de cor negra azulada con brillo verde baixo luz oblicua | Fermentación intensa; E. coli é un dos principais candidatos | Identidade da especie; outros fermentadores intensos poden presentar brillo |
| Colonia grande, mucoide, de cor rosa púrpura, sen brillo | Fermentador con carácter capsular; Klebsiella é un candidato | Klebsiella pneumoniae en concreto; Enterobacter ten un aspecto similar |
| Colonia incolora ou translúcida | Organismo que non fermenta a lactosa, por exemplo Salmonella, Shigella, Pseudomonas | De que organismo non fermentador se trata; distinguir Salmonella de Shigella require outras probas |
| Colonia pálida onde se esperaba unha vermella | Posiblemente Serratia en EMB con só lactosa a 37 C | Ausencia de Serratia; comproba a formulación e a temperatura |
| Ausencia de crecemento ou colonias diminutas con crecemento reducido | Posiblemente inhibición de grampositivos | Esterilidade ou identidade; algunhas cepas escapan á inhibición |
Tres frases resumen os aspectos que inducen a erro. Escuro non equivale a E. coli, xa que Klebsiella, Enterobacter e outros fermentadores desenvolven centros escuros sen brillo. Rosado non equivale a Klebsiella, xa que os fermentadores moderados ou lentos e algúns organismos considerados non fermentadores presentan un aspecto rosado ou lavanda. Brillo non equivale a unha identificación definitiva de E. coli, xa que outros fermentadores intensos poden producilo. O protocolo docente e as súas figuras de cultivos mixtos ilustran cada un destes erros.
Límites da confirmación
O agar EMB informa dun fenotipo, non dunha especie. Organismos distintos poden compartir un mesmo aspecto colonial, e un organismo pode afastarse da súa imaxe nos libros de texto segundo a cepa, a idade, a aglomeración, a formulación e a incubación. Por iso, os procedementos docentes e clínicos tratan a morfoloxía en EMB como presuntiva.
Un procedemento defendible para un estudante é: describir a colonia illada (tamaño, cor, centro, brillo baixo luz oblicua, carácter mucoide), rexistrar a formulación, o tempo e a temperatura de incubación e os controis; despois, subcultivar unha colonia ben illada ata obter un cultivo puro antes de calquera proba confirmatoria. As probas posteriores habituais inclúen a tinguidura de Gram xunto coas reaccións IMViC para a identificación presuntiva de E. coli e de coliformes, TSI ou KIA e paneis bioquímicos específicos para os organismos entéricos, con identificación serolóxica, mediante MALDI TOF ou por outros métodos validados cando a tarefa o requira. Para coñecer o lugar do EMB entre os medios selectivos e diferenciais para organismos entéricos, consulta as introducións aos medios de cultivo entéricos e ás probas posteriores á tinguidura de Gram. Para a cuestión relacionada do que unha tinguidura azul nun portaobxectos pode e non pode demostrar, o atlas de tinguidura con azul de metileno mantén separadas a observación e a conclusión co mesmo criterio.
Escribe a observación antes da conclusión. «Colonias escuras de cor negra azulada con brillo verde dependente do ángulo en EMB de Levine ás 24 horas, compatibles cunha fermentación intensa da lactosa» é defendible. «E. coli, confirmada» require a etapa de confirmación que a placa por si soa non pode proporcionar.