Ensaios de lévedo con azul de metileno: contar células vivas fronte a medir o tempo de respiración

Hai dous tubos na bancada. Ambos son azuis. Nun, as células azuis ao microscopio indican lévedo morto. No outro, un tubo que pasa de azul a incoloro indica que o lévedo está vivo e respira. O mesmo colorante, lecturas opostas. Se confundes os dous ensaios, todas as conclusións se inverten.

Esa distinción é o tema de todo o artigo. O azul de metileno é un colorante redox: oxidado é azul; reducido é azul de leucometileno incoloro. Un reconto de viabilidade aproveita esa química nunha breve instantánea microscópica. Un experimento de respiración aprovéitaa nunha reacción cronometrada no conxunto da mostra. Cada un precisa o seu propio protocolo, os seus propios controis e o seu propio escepticismo.

O reconto de viabilidade: unha tinguidura breve, lida sen demora

O protocolo usado na elaboración de cervexa é a versión máis estandarizada. Prepara azul de metileno ao 0.01% w/v en citrato de sodio ao 2%, mestúrao 1:1 coa suspensión de lévedo e examina a mestura tras un intervalo curto e fixo. Os intervalos publicados varían entre 1 e 2 minutos no manual do Brewing Science Institute e uns 5 minutos nos protocolos de investigación, mentres que o método de microbioloxía do viño da OIV esixe examinala antes de que transcorran 10 minutos. O colorante na mestura de reconto queda preto do 0.005%. Carga unha cámara de Neubauer mellorada e, a uns 400x, clasifica as células de cor azul escura como non viables e as non tinguidas como viables. As células de cor azul clara clasifícanse como vivas no método da OIV, o que xa apunta ao problema de subxectividade que se trata máis abaixo.

A concentración celular obtense a partir da xeometría da cámara. Cando se conta todo o cadrado central de 1 mm de lado, as células por mL son iguais a N multiplicado polo factor de dilución e por 10^4, onde N é o reconto nesa área, tal como se establece nos métodos da ASBC para lévedos. A viabilidade é máis sinxela: células non tinguidas divididas polas células totais, multiplicado por 100. Conta unhas 400 células para estimar a viabilidade, seguindo o estudo comparativo da FEMS en cervexarías e a práctica da OIV. Aplica sempre a mesma regra para os bordos; por exemplo, inclúe as células nas liñas inferior e esquerda da cuadrícula e exclúe as das liñas superior e dereita.

Cómpre establecer unha regra para as xemas antes de comezar o reconto. Unha convención habitual conta unha xema como célula independente cando alcanza aproximadamente a metade do tamaño da célula nai; por debaixo dese tamaño, cóntase xunto coa nai. Sexa cal sexa a regra escollida, aplícaa en todos os cadrados e anótaa na folla de reconto para que a seguinte persoa a repita.

Folla de reconto (imprime isto)

Esta folla de reconto é un recurso orixinal deste artigo. Cópiaa nun caderno ou imprime unha por mostra.

Viabilidade (%) = 100 x non tinguidas / (non tinguidas + azul escuro). Células totais por mL = N x factor de dilución x 10^4, con N obtido da área definida da cámara. Anota o intervalo de tinguidura xunto ao resultado, porque un valor de viabilidade sen o seu tempo de lectura non é reproducible.

Por que varían os valores de viabilidade

O tempo é a primeira interferencia, e actúa nos dous sentidos. As células metabolicamente activas reducen o colorante, polo que unha lectura temperá pode detectar células vivas antes de que rematen de reducilo e clasificalas erroneamente como mortas. Pero a exposición prolongada é tóxica por si mesma e produce células azuis realmente danadas, dando lugar a falsas indicacións de morte pola tinguidura. Por iso, un protocolo docente de laboratorio especifica que a clasificación debe facerse antes de que transcorran 5 minutos, tal como se documenta nun protocolo docente sobre lévedos de Wisconsin. A formulación prudente é que a clasificación con azul de metileno depende do tempo; por tanto, fixa un intervalo curto e manteno constante en todas as mostras dunha serie.

As mostras de baixa viabilidade presentan un segundo nesgo. O método estandarizado advirte de que o azul de metileno pode sobreestimar a viabilidade real por debaixo de aproximadamente o 80%, porque as células que aínda reducen o colorante non teñen por que conservar a capacidade reprodutiva. A bibliografía sobre elaboración de cervexa describe a mesma falta de fiabilidade cando a viabilidade está moi deteriorada. Considera o azul de metileno unha estimación rápida e aproximada, e confirma mediante recontos en placa ou unha tinguidura complementaria as decisións críticas en casos de baixa viabilidade, como reutilizar un cultivo para unha nova inoculación.

Os efectos da matriz ocupan o terceiro lugar. O método da OIV traballa preto dun pH de 4.6 e advirte de que as mostras de pH baixo cunha forte capacidade tampón impiden o comportamento correcto do colorante, ademais de desaconsellar o ensaio por riba de 100 g/L de azucre, condición na que as células presentan unha cor azul clara enganosa. Unha comparación experimental do pH de tinguidura atopou cambios substanciais na sensibilidade ao longo do intervalo ensaiado, en consonancia cun estudo do método con azul de metileno dependente do pH. Os restos son outra trampa: as partículas tinguidas en mostos con impurezas imitan células mortas e aumentan a variabilidade entre operadores.

Esa variabilidade está cuantificada, non é anecdótica. Nun ensaio de seis meses nunha cervexaría descrito na comparación de lévedos da FEMS, as medicións por duplicado con azul de metileno presentaron unha desviación estándar media do 6.1%, fronte ao 0.2% da citometría de fluxo con oxonol, e dous operadores diferiron ata 13 puntos porcentuais na mesma mostra. Unha comparación cuantitativa de métodos de viabilidade de 2023 atopou que a microscopía de fluorescencia e a citometría de fluxo eran substancialmente máis precisas, á vez que mostrou que o rendemento depende da especie e da matriz. A descrición clásica do método de Painting e Kirsop (PMID 24430080) segue sendo o punto de referencia, e unha revisión máis ampla dos ensaios de viabilidade e vitalidade dos lévedos (PMID 25154541) sitúa o azul de metileno entre as probas complementarias, non entre as definitivas. O azul de tripano non é unha mellora automática neste caso: indica a perda de integridade da membrana, mentres que o azul de metileno indica a captación e a actividade redutora, polo que as células sometidas a estrés poden clasificarse de maneira distinta cos dous colorantes.

O experimento de respiración: cronometra a desaparición do azul

O segundo ensaio non utiliza o microscopio. Introdúcense lévedo, glicosa e azul de metileno diluído nun tubo pechado, e mídese canto tarda en desaparecer o azul. A medida que as células metabolizan, xeran equivalentes redutores que converten o colorante azul na súa forma incolora, mentres que o osíxeno disolto o reoxida. Unha vez que as células reducen a cantidade de osíxeno, predomina a redución neta e o tubo perde a cor. O punto final reflicte, por tanto, o equilibrio entre a respiración, a concentración do colorante e a dispoñibilidade de osíxeno, e debe comunicarse como tempo de redución ou descoloración do azul de metileno, non como unha taxa directa de consumo de osíxeno molecular.

Utiliza un colorante moito máis diluído que nos ensaios de viabilidade para que o tempo quede nun intervalo práctico. O manual de prácticas obrigatorias de AQA para A level estandariza ben este procedemento: 1 g de glicosa por 100 mL de auga quentada a uns 30 C, 5 g de lévedo seco engadido inmediatamente antes do uso e unha solución de traballo de colorante próxima ao 0.001%, preparada diluíndo 0.1 mL dunha solución nai ao 1% ata 100 mL. Mestura 2 mL de suspensión de lévedo e glicosa con 2 mL de solución de traballo de colorante, deixa que alcance a temperatura do ensaio, axita unha vez durante 10 segundos, inicia o cronómetro e non volvas axitar. A axitación reintroduce osíxeno e devolve a cor azul ao tubo, o que constitúe o maior artefacto do procedemento. AQA sinala que a preparación debería perder a cor normalmente nuns 5 minutos a 35 C, con medias de ensaio de 275 s a 20 C, 128 s a 35 C e 145 s a 45 C. Son exemplos dunha configuración concreta, non valores de referencia universais. A relación cuantitativa entre a velocidade de redución e o lévedo metabolicamente activo en condicións controladas está apoiada por estudos específicos de redución, incluídos o traballo indexado como PMID 25773544 e o estudo mecanístico publicado en Yeast (2014).

Demostración da evolución temporal (recurso orixinal)

A táboa seguinte é unha demostración orixinal elaborada para este artigo coa configuración de tipo AQA descrita anteriormente: 2 mL de mestura de lévedo e glicosa máis 2 mL de solución de traballo de colorante próxima ao 0.001%, unha única axitación de 10 segundos e, a continuación, incubación sen perturbacións. As entradas son lecturas de exemplo no formato que debería rexistrar un grupo de estudantes, co índice de velocidade definido como 1 dividido polo tempo de descoloración en segundos. Realiza o ensaio cos mesmos tubos e substitúe estas entradas por valores medidos.

Representa o índice de velocidade fronte á temperatura para os tubos A, B e C. A curva sobe e logo estabilízase ou baixa, que é o patrón esperado dun proceso impulsado por encimas, non unha liña recta. Os tubos D, E e F non son puntos de datos desa curva. Son os controis que permiten interpretala.

Controis que lle dan significado a cada ensaio

Cada ensaio de respiración precisa tres acompañantes. O lévedo fervido ou morto, xunto coa glicosa e o colorante, debe permanecer azul, demostrando que a redución rápida depende do metabolismo vivo. O lévedo vivo con colorante e sen glicosa engadida é un control de substrato, pero cabe esperar unha descoloración lenta de todos os xeitos, xa que o lévedo consume as súas reservas endóxenas. A glicosa con colorante e sen lévedo é o branco químico, esencial porque a glicosa en medio alcalino pode reducir o azul de metileno sen presenza de células.

O reconto de viabilidade precisa outro tipo de control: a constancia do procedemento. A mesma solución nai de colorante, a mesma proporción de mestura, o mesmo intervalo de tinguidura, a mesma área da cámara, as mesmas regras para as xemas e os bordos, e recontos a cegas sempre que sexa posible. Cando dous operadores difiren en dez puntos, a folla de reconto adoita revelar a causa: tempos distintos, limiares distintos para a cor azul ou regras distintas para as xemas. As técnicas para preparar e observar células tinguidas están relacionadas cos métodos de tinguidura bacteriana simple, mentres que unha visión máis ampla do que marca o colorante en diferentes mostras se atopa no atlas de tinguidura para microscopía. Para entender a física que permite ler cuantitativamente calquera intensidade de azul, a referencia de absorción coas condicións indicadas explica por que cada coeficiente debe ir acompañado das súas condicións de disolvente, pH e concentración.

Escolle o ensaio segundo a pregunta. Cantas células están vivas agora mesmo é unha pregunta de reconto, que se responde ao microscopio cunha folla de rexistro. Con canta actividade respira este cultivo é unha pregunta cinética, que se responde cun cronómetro e tubos en condicións controladas. O azul de metileno serve para ambos, pero nunca no mesmo tubo ao mesmo tempo.