Azul de metileno para a tinción de ADN e ARN: aplicacións en xeles e membranas

Un estudante realiza unha electroforese nun xel de agarosa, tíngueo con azul de metileno e non ve nada onde esperaba unha banda intensa. No posto do lado, unha investigadora posdoutoral tingue unha membrana Northern co mesmo frasco azul e obtén bandas ribosómicas nítidas en tres minutos. O estudante conclúe que o xel fallou. O xel non fallou. As dúas tarefas eran distintas, e o mesmo colorante responde a elas cunha sensibilidade diferente, un fondo diferente e regras diferentes para o que vén despois.

A tinción de ADN e a tinción de ARN con azul de metileno comparten a química, pero non a finalidade. Nun xel, o colorante indica canto ácido nucleico hai dentro dunha matriz porosa. Nunha membrana, indica se a transferencia funcionou e se os carrís se cargaron de maneira uniforme. Unha vez que esa distinción está clara, os protocolos, os límites de detección e os límites de compatibilidade encaixan.

A resposta breve

O azul de metileno é un colorante catiónico plano que se une aos ácidos nucleicos de maneira non covalente e reversible, mediante unha combinación de atracción electrostática cara ao fosfato, intercalación entre pares de bases e asociación co suco menor. Esa reversibilidade é a clave. As bandas poden tinguirse para a súa observación con luz visible, documentarse e logo destinguirse ou purificarse para clonación, hibridación ou unha nova hibridación con sonda.

Para a tinción de ADN bicatenario con azul de metileno en xeles de agarosa, a preparación rápida estándar é de 0.02 por cento w/v (200 microgramos por mL) en auga, con uns 15 minutos de tinción máis uns 15 minutos de destinción con auga, e observación nunha caixa de luz branca. Para as membranas, a preparación clásica para Northern blot é de 0.02 a 0.04 por cento de colorante en acetato de sodio preto de pH 5.2, varios minutos de tinción despois da transferencia e da inmobilización, e logo un enxaugado con auga e unha destinción completa antes da hibridación. A sensibilidade é modesta: de decenas a centos de nanogramos por banda de xel en boas condicións, e as guías conservadoras indican de 0.5 a 1 microgramo. Iso está varias ordes de magnitude por riba do bromuro de etidio e dos colorantes SYBR. Nas membranas non hai un límite de detección único e útil para un transcrito, porque a tinción mostra principalmente o ARN ribosómico abundante e o material total cargado. Non substitúas ningunha destas preparacións por unha solución de suplemento de venda ao público. Os métodos validados presupoñen un colorante de grao analítico, tampóns definidos e manipulación libre de RNase cando se traballa con ARN.

Como funciona a unión e onde pode levar a erro

O modelo útil ten tres partes. Primeiro, o sistema de aneis con carga positiva é atraído polo esqueleto de fosfato con carga negativa. Os estudos espectroscópicos indican que esta contribución electrostática domina a baixas concentracións de sal, mentres que a modelización e a dinámica molecular manteñen a intercalación e a unión ao suco menor como modos estables para o ADN bicatenario, tal como se resume nun estudo espectroscópico da unión do azul de metileno ao ADN. Segundo, existe certa preferencia por GC: a modelización favorece os pasos CpG e GpC, e os experimentos describen unha asociación preferente con dúplex ricos en GC nos traballos sobre as preferencias de intercalación do azul de metileno, pero os dúplex AT tamén se unen ao colorante. A tinción habitual non é específica dunha secuencia. Terceiro, o ADN monocatenario e o ARN únense principalmente mediante interaccións electrostáticas e apilamento con bases accesibles e rexións dúplex, polo que a intensidade da tinción varía coa lonxitude, a secuencia e a estrutura secundaria.

Diso derivan dúas consecuencias. Como a unión é non covalente, o colorante elimínase co lavado. As bandas de poliacrilamida esvaécense axiña a menos que se fixen deliberadamente, e existe unha variante específica de fixación permanente precisamente porque a tinción normal é temporal, como describen Soto e Draper para os xeles PAGE. Como o colorante é un fotosensibilizador, a iluminación intensa e prolongada do ADN tinguido en presenza de osíxeno pode oxidar a guanina e acabar provocando cortes nunha das cadeas, un mecanismo detallado nos traballos sobre a oxidación da guanina fotosensibilizada polo azul de metileno. A observación breve con luz branca evita o coñecido dano por UV dos procedementos clásicos con bromuro de etidio, e esa vantaxe é real para a recuperación preparativa. A luz visible é menos agresiva, pero non inocua. Mantén breve a iluminación cando o ADN se vaia clonar. Para coñecer a fotoquímica máis ampla que explica esa precaución, consulta as dúas vías da fotoquímica do azul de metileno. Para o par redox e os estados de carga que explican por que a forma oxidada se une e a reducida non, consulta a química da estrutura e das propiedades do azul de metileno.

Primeira tarefa: tinción dentro dos xeles

A tinción en xel responde a unha pregunta: hai suficiente ácido nucleico nesta banda para velo a simple vista? O ADN bicatenario en agarosa é o caso mellor caracterizado. O método orixinal de tinción de xeles con azul de metileno de Flores e colaboradores validou o protocolo rápido ao 0.02 por cento en agarosa ao 1 por cento e demostrou unha recuperación e clonación satisfactorias posteriores. O mesmo protocolo do provedor aparece na páxina do produto azul de metileno de IBI Scientific, que presenta xuntas a preparación ao 0.04 por cento para membranas e a variante rápida para xeles.

Procedemento práctico:

1. Realiza a electroforese do xel como de costume. Tingue despois da electroforese, non durante ela, a menos que se validase a transferencia ou a resolución para un método modificado.
2. Mergulla o xel en azul de metileno ao 0.02 por cento w/v en auga destilada, con axitación suave, durante uns 15 minutos.
3. Destingue con varios cambios de auga, durante uns 15 minutos en total, ata que diminúa o fondo da matriz e destaquen as bandas.
4. Fotografía de inmediato nun iluminador de luz branca.

A agarosa e a poliacrilamida compórtanse de forma diferente. A agarosa retén o colorante na matriz, polo que a destinción é o paso lento. Os xeles finos de poliacrilamida tínguense axiña, pero tamén perden o colorante axiña, o que facilita o recorte preparativo e dificulta os rexistros de arquivo. Os oligonucleótidos sintéticos en poliacrilamida poden localizarse coa mesma preparación ao 0.02 por cento en 20 a 30 minutos, con lavados repetidos con auga, seguindo métodos PAGE establecidos do tipo Current Protocols. Describíronse variantes moi diluídas, próximas ao 0.0002 por cento en TBE diluído, para oligonucleótidos preparativos durante varias horas, pero a base de evidencias é máis feble.

A diferenza entre ADN e ARN importa. O ADN bicatenario produce a unión estruturada máis forte. O ARN e o ADN monocatenario tínguense, pero de maneira máis feble e menos predicible. Para os xeles de ARN de agarosa con formaldehido, a maioría dos laboratorios omiten a tinción azul no xel e transfiren primeiro o ARN a unha membrana para tinguilo alí. Ese cambio substitúe un sinal feble no xel por un sinal máis nítido na membrana, ademais dun rexistro da carga.

Segunda tarefa: tinción sobre membranas

A tinción de membranas responde a unha pregunta distinta: funcionou a transferencia e son comparables os carrís? A aplicación clásica é a tinción reversible de Northern blot de Herrin e Schmidt, orixinalmente con colorante ao 0.04 por cento en acetato de sodio 50 mM a pH 5.0 durante 2 a 3 minutos, cun enxaugado con auga, e eliminable con SDS diluído en SSPE antes da hibridación.

A variante moderna de uso estendido realízase así:

1. Transfire ARN ou ADN desnaturalizado a nailon ou nitrocelulosa e logo inmobilízao mediante entrecruzamento con UV ou quentamento, para que a mostra non se perda durante a tinción.
2. Opcional, pero habitual: humedece a membrana en ácido acético ao 5 por cento durante uns 15 minutos.
3. Tingue durante 5 a 10 minutos con azul de metileno ao 0.02 a 0.04 por cento en acetato de sodio de 0.3 a 0.5 M preto de pH 5.2.
4. Enxauga e destingue con auga durante 5 a 15 minutos, documenta e logo elimina o colorante residual antes da hibridación.

O nailon con carga positiva predomina nos traballos con Northern. A nitrocelulosa tamén funciona co mesmo procedemento de ácido acético máis acetato. A imaxe úsase para confirmar a transferencia, comparar as bandas 28S e 18S (ou 23S e 16S para o ARN bacteriano), marcar os marcadores de tamaño e os estándares, e conservar un rexistro aproximado para a normalización polo ARN total. Os métodos Northern publicados cuantifican as bandas ribosómicas tinguidas para comprobar a carga, incluídos traballos de ciencia láctea que empregaron bandas ribosómicas tinguidas con azul de metileno para a normalización. As membranas Southern poden visualizarse do mesmo xeito, pero o colorante está moito máis consolidado como control da carga e da transferencia en Northern, e o ADN de Southern desnaturalízase antes da transferencia, polo que as cifras de sensibilidade dos xeles non son aplicables.

Límites de detección e fondo: onde perde o azul

A comparación seguinte é deliberadamente aproximada. O rendemento da tinción depende da porcentaxe do xel, da largura das bandas, da óptica e do rigor na destinción. Considera cada número como unha orde de magnitude, non como unha especificación.

O control do fondo determina se o sinal modesto é utilizable. O colorante libre ten unha cor intensa, polo que o contraste conséguese eliminando o colorante non unido sen retirar o unido. Unha tinción máis concentrada rara vez aumenta a sensibilidade. Principalmente aumenta o tempo de destinción. Realiza unha serie de dilucións co xel, a membrana e a cámara concretos, e utiliza só o intervalo no que a densidade integrada se mantén proporcional á cantidade introducida. O azul de metileno permite unha normalización semicuantitativa da carga. Non é un ensaio cuantitativo de amplo rango dinámico, porque a capacidade da membrana, a eficiencia da transferencia, a saturación e a destinción varían dun carril a outro.

Límites de compatibilidade: que resiste a tinción

A clonación despois da tinción azul está demostrada. Flores e colaboradores recortaron bandas tinguidas de agarosa, recuperaron o ADN e realizaron a ligación e a transformación, e describiron unha clonación mellor que despois de usar bromuro de etidio con UV. A razón probable é un menor dano fotoquímico, non un beneficio do propio colorante. Mantén breve a exposición á luz branca e somete o ADN recuperado a unha purificación habitual de extracción de xel.

As evidencias para PCR e secuenciación son máis limitadas. O colorante residual únese aos ácidos nucleicos, polo que debes destinguir e purificar antes dos pasos enzimáticos. Espérase que o ADN correctamente purificado dun xel tinguido de azul funcione, pero a tolerancia á presenza residual directa do colorante nas distintas polimerases e químicas de secuenciación non está ben cuantificada. Non a deas por suposta.

A hibridación en membrana é compatible cando se respecta estritamente a orde: transferir, inmobilizar, tinguir, documentar, destinguir e hibridar. Esa secuencia é o deseño de Herrin e Schmidt. Tinguir antes da transferencia ou omitir a destinción constitúe un método diferente e require a súa propia validación. Unha vez eliminado o colorante, a retirada estándar da sonda e a nova hibridación con sonda continúan con normalidade. Para a tinción a nivel celular coa mesma familia de colorantes e para entender por que a lóxica dos preparados fixados non se pode trasladar aos métodos con células vivas, consulta o atlas de tincións de microscopía.

O recorte de bandas funciona para a agarosa preparativa e para os oligonucleótidos en PAGE localizados con azul, sempre que se evite a variante de fixación permanente. A electroelución despois da destinción é quimicamente plausible para un axente de unión reversible, pero os datos controlados de rendemento específicos do azul de metileno son escasos. Desala ou precipita despois da elución.

Fallos que se repiten

As bandas febles no xel adoitan indicar unha masa insuficiente para unha tinción colorimétrica, especialmente para dianas curtas monocatenarias ou de ARN. Carga máis cantidade, utiliza colorante fresco, prolonga a tinción antes de aumentar a concentración e detén antes a destinción. Un xel completamente azul sen contraste adoita indicar unha tinción excesiva ou moi poucos cambios de auga. O esvaecemento das bandas PAGE é unha consecuencia química esperable, non unha tinción fallida. Fotografía axiña. Un fondo irregular na membrana apunta a pregamentos, burbullas, pegadas dixitais, axitación desigual ou transferencia irregular. Non o interpretes como unha carga desigual sen un control de hibridación. Un patrón ribosómico feble e difuso pode indicar degradación, pero tamén unha transferencia incompleta, unha cantidade insuficiente de ARN total (os carrís habituais conteñen de varios a decenas de microgramos) ou unha destinción excesiva. O colorante indica o ARN ribosómico abundante. Non indica un transcrito específico. Esa tarefa correspóndelle á sonda.

Seguridade e manipulación sen esaxeracións

O azul de metileno é máis sinxelo de manipular que o bromuro de etidio, pero non é inocuo. Unha ficha de datos de seguridade actual de MilliporeSigma clasifica o colorante na categoría 4 de toxicidade oral aguda, nocivo en caso de inxestión, e require a eliminación mediante unha vía de residuos autorizada, segundo a ficha de datos de seguridade do azul de metileno de Sigma-Aldrich. O bromuro de etidio leva advertencias máis severas de xenotoxicidade, incluídos posibles efectos nas células xerminais na súa ficha de datos de seguridade de Sigma-Aldrich, e os seus xeles e solucións adoitan separarse como residuos químicos perigosos, como se indica na guía de colorantes para ácidos nucleicos de Thermo Fisher. Sigue a ficha de datos de seguridade e as normas institucionais para ambos. Mantén o colorante seco ben pechado e sen humidade, reutiliza a solución de tinción de traballo só cando o protocolo o permita, garda as membranas tinguidas secas entre follas de papel de filtro e fotografía os xeles antes de que as bandas se dispersen por difusión.

Lembra a frase para a bancada. Os xeles comproban a visibilidade con cargas elevadas baixo luz branca. As membranas comproban a transferencia e a carga antes de que a sonda realice o traballo sensible. Un colorante serve para ambas as tarefas, cunha sensibilidade modesta, unha unión reversible e unha orde estrita das operacións.