Artigo
O azul de metileno nas probas de laboratorio de G6PD: que fai realmente o colorante
Un estudante observa dous tubos despois da incubación. Un adquiriu a cor esperada. O outro non. O estudante conclúe que o segundo paciente ten unha deficiencia de glicosa-6-fosfato deshidroxenase. Esa conclusión pode ser correcta, pero o razoamento pasa por alto o concepto que permite que a proba funcione. Nada no tubo mide a encima directamente. O tubo mide o que produce a encima, empregando o azul de metileno como intermediario.
Unha vez que se entende esa medición indirecta, o procedemento, os controis e a longa lista de resultados falsos deixan de parecer arbitrarios.
A resposta breve
O azul de metileno nas probas de G6PD é un indicador redox. A encima G6PD xera NADPH, e os sistemas dependentes de NADPH reducen o azul de metileno á súa forma leuco incolora (ou úsano para transferir electróns). Unha actividade encimática normal permite unha redución eficiente. Unha actividade deficiente produce unha redución lenta ou incompleta. Ese é todo o sinal.
Dous métodos históricos comparten o colorante, pero difiren no criterio final de lectura. Se se distinguen, desaparece a maior parte da confusión.
Dúas probas, un colorante, distintos criterios finais de lectura
A primeira é a proba de redución directa do azul de metileno, descrita por Sass e os seus colaboradores e avaliada posteriormente por Gibbs. Aquí, a lectura final é o propio colorante: o azul de metileno oxidado, de cor azul, redúcese cara ao leucoazul de metileno incoloro, e a velocidade dese cambio reflicte a capacidade de xerar NADPH. O artigo orixinal sobre o cribado está indexado en PubMed como Sass et al. (1966).
A segunda é a proba de redución da metahemoglobina de Brewer. Primeiro, o nitrito de sodio oxida a hemoglobina a metahemoglobina marrón. Despois, o azul de metileno actúa como mediador da transferencia de electróns: o azul de metileno reducido transfire equivalentes redutores á metahemoglobina, converténdoa de novo en hemoglobina vermella. Polo tanto, a lectura visible distingue entre marrón e vermello, non entre azul e incoloro. O método orixinal publicouse no Boletín da Organización Mundial da Saúde (Brewer et al., 1960).
Chamar ao ensaio de Brewer unha proba de decoloración do colorante é quimicamente impreciso. O colorante pasa por un ciclo; a hemoglobina cambia de cor. O diagrama seguinte mostra ambas as vías.
A reacción subxacente
A G6PD cataliza o primeiro paso oxidativo da vía das pentosas fosfato:
Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+
Os glóbulos vermellos maduros dependen en gran medida desta vía para obter NADPH, como se describe na revisión de Luzzatto e os seus colaboradores en Blood (2020). O NADPH mantén o glutatión reducido e protexe a célula fronte ao dano oxidativo. O azul de metileno intégrase neste sistema como aceptor de electróns. Unha cantidade suficiente de G6PD proporciona suficiente NADPH, o que permite unha redución eficiente. Un nivel baixo de G6PD rompe a cadea no seu primeiro elo.
Pensa no colorante como nun indicador de combustible, non como no motor. Informa sobre a dispoñibilidade de NADPH. Calquera outro factor que altere esa dispoñibilidade, ou a lectura, pode mover a agulla sen que haxa ningún cambio no xene.
Como se realiza o procedemento de tipo Brewer
As formulacións dos reactivos variaron ao longo das décadas, polo que unha descrición didáctica non debe confundirse cun protocolo clínico. Cada laboratorio segue o seu propio procedemento normalizado de traballo validado. Con esa advertencia, a montaxe clásica con tubos funciona do seguinte xeito, nunha modalidade documentada con tres tubos e unha incubación de 3 horas en esta aplicación publicada:
- Tubo do paciente: sangue total máis glicosa, nitrito de sodio e azul de metileno. O nitrito produce metahemoglobina, a glicosa alimenta o metabolismo dos glóbulos vermellos e o colorante proporciona o mecanismo de transferencia dependente de NADPH.
- Control oxidado: sangue máis nitrito e glicosa, pero sen azul de metileno. Mostra a cor marrón da metahemoglobina como referencia final, o patrón de deficiencia.
- Control de hemoglobina: sangue máis auga. Mostra a cor vermella da hemoglobina como referencia final, o patrón normal.
- Incubar todos os tubos preto de 37 C, normalmente durante 3 horas, mesturando suavemente.
- Diluír unha pequena alícuota de cada tubo en auga destilada para lisar as células e facilitar a comparación das cores.
- Comparar o tubo do paciente cos dous controis. O retorno cara ao vermello indica unha capacidade redutora considerable. A persistencia dunha cor próxima ao marrón suxire unha deficiencia marcada.
Unha formulación histórica empregaba arredor de 1 mL de sangue con reactivos próximos a 180 mM de nitrito de sodio, 280 mM de dextrosa e 0.4 mM de azul de metileno. Considera estas cifras un exemplo da literatura, non unha especificación universal.
Lectura do resultado
| Patrón | Aspecto na proba de Brewer | Significado |
|---|---|---|
| Normal | O tubo do paciente achégase ao control vermello de hemoglobina | Capacidade redutora por riba do limiar do cribado |
| Deficiente | O tubo do paciente permanece marrón, próximo ao control de metahemoglobina | O cribado suxire unha deficiencia marcada de G6PD |
| Intermedio | A cor queda entre as dos controis | Non asignar un fenotipo; medir a actividade de forma cuantitativa |
Un cribado cualitativo discrimina mellor arredor do 30 ao 40 por cento da actividade normal, como se explica nesta revisión de Malaria Journal sobre as limitacións na detección de G6PD. Polo tanto, un resultado normal no cribado significa que o ensaio non detectou unha deficiencia grave. Non certifica unha actividade completamente normal.
Por que o cribado pode enganar
A reticulocitose despois dunha hemólise é a causa clásica dun resultado falsamente normal. Os glóbulos vermellos novos e os reticulocitos conteñen máis G6PD ca as células vellas. Durante un episodio hemolítico agudo, as células máis vellas e máis deficientes poden estar xa destruídas, deixando unha poboación nova cuxa actividade dá un resultado normal na proba. O mesmo fenómeno biolóxico engana os ensaios cuantitativos, non só os cribados con colorante.
Unha transfusión recente enmascara a deficiencia porque os glóbulos vermellos do doante achegan a súa propia encima á mostra. Mayo Clinic Laboratories inclúe a transfusión entre as causas de resultados encimáticos pouco fiables, xunto coa reticulocitose e a interferencia dos leucocitos.
As mulleres heterocigotas son o caso máis difícil. A inactivación aleatoria do cromosoma X produce unha mestura de glóbulos vermellos normais e deficientes, e a actividade global pode situarse en calquera punto entre unha deficiencia grave e unha aparente normalidade. Os cribados cualitativos non detectan con frecuencia os fenotipos intermedios. A documentación da OMS sobre as probas de G6PD trata esta limitación en detalle.
A antigüidade da mostra, a temperatura de conservación, a subxectividade da lectura visual final, o hematócrito e a calidade dos reactivos engaden ruído analítico a estes efectos biolóxicos.
O cribado non é un diagnóstico
Un resultado de cribado deficiente, intermedio ou discordante coa situación clínica require un ensaio cuantitativo da actividade encimática de G6PD. A OMS considera a espectrofotometría cuantitativa con temperatura controlada como o método de referencia. Nese ensaio, engádense glicosa-6-fosfato e NADP+ a un hemolisado de glóbulos vermellos, e o NADPH formado mídese mediante o aumento da absorbancia a 340 nm. A velocidade do cambio é proporcional á actividade encimática, normalmente normalizada respecto á hemoglobina como unidades por gramo. A práctica actual dos laboratorios clínicos resúmese na entrada do catálogo de probas de Mayo sobre a actividade de G6PD.
A interpretación emprega o intervalo de referencia validado polo laboratorio, a miúdo expresado en relación coa actividade normal da poboación; a deficiencia adoita situarse arredor do limiar do 30 por cento, e a actividade intermedia por riba del. Os perfís de produto obxectivo da OMS para as probas de G6PD (2022) establecen ese marco diagnóstico. Se unha hemólise ou unha transfusión recente fan que a determinación do fenotipo sexa pouco fiable, débese repetir a proba unha vez que a poboación de glóbulos vermellos recupere o equilibrio; as probas moleculares poden achegar información sen substituír a medición da encima.
Unha distinción que convén manter
O azul de metileno nestes ensaios é un reactivo de laboratorio ex vivo. Ese feito pertence a unha cuestión distinta da seguridade de administrar azul de metileno a un paciente, que se aborda na guía sobre as contraindicacións do azul de metileno. A bioquímica relaciona ambas as cuestións, xa que o fármaco tamén depende da redución dependente de NADPH, pero un colorante nun tubo de ensaio non é unha dose no torrente sanguíneo. Para coñecer como se comporta o colorante como tinguidura noutro contexto, consulta os principios da tinguidura con azul de metileno; para coñecer a familia química á que pertence, os colorantes redox no laboratorio.
O cribado pregunta se a capacidade redutora parece intacta. A confirmación pregunta canta encima hai realmente. O colorante responde ben á primeira pregunta, sempre que ninguén lle pida responder á segunda.