Azul de metileno na investigación con peixe cebra: aditivo de mantemento e factor de confusión experimental

A auga para ovos de peixe cebra adoita ter unha tenue cor azul, e case ninguén anota o motivo. O colorante é azul de metileno, engadido para combater os fungos, e a maioría dos protocolos trátano como un elemento de fondo. Aquí, esa non é a consideración axeitada. É mellor entendelo como un factor experimental non declarado: algo presente nas placas tratadas e ausente nos controis, farmacoloxicamente activo ás concentracións empregadas e capaz de modificar as propias variables que mide o experimento.

Esa distinción organiza todo o que segue. O mantemento antifúnxico de rutina é unha cuestión. Se o aditivo é neutro para o teu ensaio é outra distinta. A bibliografía recente sobre peixe cebra responde á primeira de xeito tranquilizador e á segunda de xeito incómodo.

Que prescriben realmente as directrices

Non hai un único estándar, e iso é parte do problema. As directrices do Consello Canadense de Coidado dos Animais permiten 0.5 mg/L, ou 0.00005%, na solución de transporte de ovos e larvas para reducir o crecemento de fungos. As directrices europeas sobre animais de laboratorio describen embrións mantidos nun medio que adoita conter esa mesma concentración de 0.00005%. A receita E3 de Cold Spring Harbor especifica o dobre, 1 mg/L ou 0.0001%, como ingrediente. Fronte a isto destaca unha omisión: a directriz da OCDE para o ensaio de toxicidade en embrións de peixe especifica auga de dilución reconstituída e a substancia de ensaio, sen recomendar azul de metileno nin na versión de 2013 nin na revisión posterior. Así, un laboratorio cría embrións de peixe cebra con azul de metileno en auga azul desde as primeiras horas de vida, outro realiza o ensaio regulamentario con embrións en auga transparente, e ambos consideran normal o seu medio. Quen compare resultados entre laboratorios ou agrupe controis históricos herda esa inconsistencia.

Para contextualizar as concentracións, 0.00005% equivale a aproximadamente 1.56 micromolar e 0.0001% a aproximadamente 3.13 micromolar. Son cifras baixas, e resulta tentador interpretalas como demasiado baixas para importar. Os estudos que se presentan a continuación poñen a proba precisamente esa suposición, exactamente con esas concentracións.

Quen chega desde a acuariofilia, e non desde o laboratorio, atopa a mesma molécula nun contexto distinto, tratado na guía do azul de metileno para acuarios. A química é a mesma; a explicación de como o colorante transporta electróns polas células axuda a entender por que un composto activo en reaccións redox aparece unha e outra vez nos artigos sobre metabolismo. O que segue refírese especificamente á auga para ovos de peixe cebra con azul de metileno.

Metabolismo: o efecto cambia de signo segundo a etapa

O estudo máis informativo expuxo peixes cebra cun desenvolvemento normal desde o primeiro día de vida ata os 5 días posteriores á fecundación e mediu o metabolismo oxidativo en cada etapa, tal como describe o informe publicado dos experimentos sobre metabolismo embrionario. Convén expoñer o patrón con coidado porque cambia de dirección.

Ao 1 día posterior á fecundación, o consumo basal de osíxeno aumentou nos embrións expostos ás dúas concentracións de mantemento. Aos 2 días, o potencial da membrana mitocondrial na capa superficial das larvas estaba elevado nas exposicións a 0.00005%, 0.0001% e 0.0003%. Aos 4 a 5 días, despois da eclosión, o signo invertérase: o gasto enerxético oxidativo diminuíu, tanto se a exposición fora continua desde a fecundación como se fora aguda, só do día 3 ao día 4. En paralelo, diminuíron os transcritos das subunidades dos complexos respiratorios mitocondriais tanto ao 1 como aos 4 días, xunto cos transcritos relacionados coa esteroidoxénese e a gliconeoxénese.

Outras dúas observacións completan o panorama. A eclosión adiantouse lixeiramente coa concentración de mantemento máis alta: os embrións expostos ían por diante aos 2 días, e os controis alcanzáronos no día 3. Ademais, o propio eixe do estrés parecía intacto: cando se someteron larvas de 5 días a un estímulo estresante de axitación en remuíño, o cortisol no corpo enteiro aumentou con normalidade nos dous grupos. Polo tanto, o colorante non é un tóxico xeral para o desenvolvemento a estas doses, nin atenúa todas as respostas fisiolóxicas. Modifica o metabolismo enerxético en función da etapa, aumentándoo antes da eclosión e reducíndoo despois.

Comportamento: por que dous estudos discrepan e por que ambos poden ter razón

A bibliografía sobre comportamento parece contraditoria ata que se comparan os deseños de exposición. Un estudo de seguridade no desenvolvemento e no comportamento expuxo embrións desde aproximadamente as 6 horas posteriores á fecundación a concentracións de ata 10 micromolar, renovou as solucións a diario ata o día 4, trasladou despois as larvas a un medio sen colorante durante os días 5 e 6 e avaliou a locomoción nun ensaio de luz-escuridade no día 6. Resultado: ningún efecto significativo sobre a mortalidade, a eclosión ou a morfoloxía, e ningún efecto do tratamento sobre a locomoción. Os autores recomendaron razoablemente 10 micromolar como límite superior nas súas condicións.

Un segundo grupo, con autores en común co estudo sobre metabolismo, realizou a exposición tal como se fai na práctica de mantemento: colorante presente desde as 2 a 3 horas posteriores á fecundación, con renovación parcial diaria, e medición do comportamento mentres a exposición seguía en curso ou era recente. Coas mesmas concentracións habituais, as larvas mostraron unha locomoción reducida nun ensaio de 24 horas, reproducible entre liñaxes e laboratorios, e o estudo sobre confusión nos ensaios de comportamento apuntou ao ton serotoninérxico como explicación do efecto, en consonancia coa coñecida inhibición da monoaminooxidase polo colorante. O máis revelador foi que o medio embrionario con azul de metileno enmascarou a resposta locomotora esperada ao ISRS fluoxetina. Polo tanto, un ensaio de cribado realizado en auga azul pode pasar por alto un efecto farmacolóxico que a auga transparente revelaría.

Non hai unha contradición real. Un composto pode non deixar ningún efecto residual detectable dous días despois da súa eliminación nun ensaio e seguir activo mentres está presente noutro. A interpretación práctica é que o resultado nulo permite establecer un límite superior de concentración, non afirmar a neutralidade, mentres que o resultado positivo describe o risco relevante: a exposición activa durante o período de medición, coa configuración exacta que usa a maioría dos laboratorios.

Un colorante redox dentro dun ensaio redox

Hai outra trampa que merece o seu propio parágrafo porque altera o instrumento de medida, non o animal. O ensaio de gasto enerxético Alamar Blue baséase en química redox: a resazurina redúcese a resorufina fluorescente. O azul de metileno tamén participa en química redox. Nos controis sen células, ambas as concentracións de mantemento reduciron lixeiramente, pero de forma significativa, a fluorescencia de Alamar Blue despois de 24 horas. Nos experimentos con animais, os embrións expostos laváronse polo menos tres veces nun medio sen colorante antes do ensaio, e o efecto biolóxico nas larvas xa eclosionadas superou a interferencia observada sen células. Polo tanto, ambas as cousas son certas: os animais lavados conservan un efecto metabólico real, e o colorante non eliminado polo lavado engade un artefacto químico directo. Os controis deben separar os dous efectos; doutro xeito, ningunha das cifras ten significado. As orientacións xerais sobre a interpretación dos resultados de ensaios baseados en colorantes son especialmente pertinentes aquí.

Cronoloxía das etapas do desenvolvemento

O recurso orixinal deste artigo. As concentracións son os dous valores estándar de mantemento, 0.00005% e 0.0001%, agás cando se indique outra cousa.

O patrón que hai que lembrar é un aumento inicial e unha diminución posterior das variables metabólicas, con efectos sobre o comportamento presentes durante a exposición e indetectables tras a depuración no único ensaio que a avaliou.

Lista de comprobación para o deseño dos controis

O segundo recurso orixinal. Úsao cando os protocolos de peixe cebra con azul de metileno se combinen cun experimento.

1. Declara o colorante como reactivo, non como auga. Indica a concentración tanto en porcentaxe como en micromolar, o inicio e o final en horas ou días posteriores á fecundación, o calendario de renovación e o intervalo de eliminación do colorante antes de cada medición.
2. Adapta os controis á pregunta. Un estudo da substancia de ensaio precisa controis sen colorante; un estudo de mantemento precisa grupos sen colorante e con colorante, rexistrando o resultado antifúnxico, xa que ningún dos estudos citados mediu a eficacia antifúnxica.
3. Lava antes dos ensaios redox e despois verifica. Enxauga polo menos tres veces nun medio sen colorante e realiza en paralelo un control sen células que conteña colorante e reactivo, porque o colorante reduce directamente o sinal de Alamar Blue.
4. Considera de alto risco as variables de comportamento e de monoaminas. Os estudos de locomoción, resposta de sobresalto, comportamento semellante á ansiedade, antidepresivos e inhibidores da MAO deben evitar o colorante durante a medición ou demostrar a súa neutralidade para cada variable concreta; un período de eliminación de un a dous días suprimiu un efecto locomotor, pero non está demostrado para outros paradigmas.
5. Considera de alto risco as variables metabólicas e mitocondriais en todas as etapas. O consumo de osíxeno, o gasto enerxético, o potencial de membrana e os transcritos da cadea respiratoria cambian ás concentracións de mantemento, en direccións opostas antes e despois da eclosión.
6. Non extrapoles a neutralidade entre deseños. Un resultado nulo tras a eliminación do colorante non é aplicable á exposición continuada; un resultado morfolóxico nulo non é aplicable ao metabolismo nin á interacción con fármacos; un resultado nunha liñaxe, temperatura ou duración do ensaio non é aplicable ás demais.
7. Indica a directriz que seguiches e a súa alternativa. Especifica expresamente as concentracións do CCAC, das directrices europeas ou de Cold Spring Harbor, e sinala onde o ensaio con embrións da OCDE omite o colorante, para que quen lea o estudo poida contextualizar os teus animais.

Nada disto é un argumento contra o uso do colorante para manter vivos os ovos. É un argumento contra permitir que unha decisión de mantemento pase aos datos sen ser examinada. O azul da placa é unha molécula cunha farmacoloxía propia, e os experimentos con maior probabilidade de verse distorsionados son precisamente os cribados metabólicos e neurocondutuais de alto rendemento para os que hoxe se prefiren peixes cebra novos. Rexístrao, contrólao, elimínao antes de medir e comproba o ensaio no que podería estar participando silenciosamente.