Azul de metileno e sinalización inflamatoria: inflamasomas, IL-6 e STAT3

Supoñamos que tres laboratorios comunican que o mesmo composto azul é antiinflamatorio. Un mostra menos IL-1beta procedente dos macrófagos. Outro mostra menos encima iNOS no mesmo tipo celular. Outro mostra menos IL-6 no sangue e menos actividade de STAT3 no cerebro. A tentación é fusionar os tres resultados nunha única afirmación. Esa fusión oculta o achado.

Cada resultado pertence a un concepto de sinalización diferente, co seu propio estímulo desencadeante, paso de ensamblaxe e indicador medido. O azul de metileno actúa sobre cada concepto nun punto distinto. Se algo disto mellora un resultado de saúde é unha cuestión separada, que se aborda na nosa visión xeral do azul de metileno e a inflamación. Esta páxina céntrase nas vías.

Vía 1: ensamblaxe do inflamasoma e caspase-1

Un inflamasoma é unha armazón proteica que se constrúe segundo a demanda dentro dunha célula mieloide. Os seus compoñentes son un sensor, un adaptador chamado ASC e un encima efector chamado caspase-1. Unha vez ensamblado, a caspase-1 escinde a pro-IL-1beta e a pro-IL-18 para producir as súas formas secretadas e pode desencadear a piroptose, unha forma inflamatoria de morte celular. O sensor define o tipo: NLRP3 responde a cristais e toxinas formadoras de poros, como a nixericina e o ATP; NLRC4 responde á flaxelina bacteriana; AIM2 responde ao ADN citosólico de dobre cadea; e a vía non canónica responde ao lipopolisacárido intracelular.

A activación precisa dous sinais. O primeiro sinal é a preparación: un ligando dun receptor de tipo Toll impulsa a transcrición de NLRP3 e pro-IL-1beta dependente de NF-kB para que existan os compoñentes. O segundo sinal é a ensamblaxe: un segundo estímulo fai que ASC oligomerice formando agregados puntiformes, que a caspase-1 se escinda para producir o seu fragmento p20 e que se libere a IL-1beta p17 madura. As especies reactivas do osíxeno mitocondriais e a captación de cristais son factores coñecidos que contribúen ao segundo sinal de NLRP3.

O estudo de 2017 sobre a inhibición de varios inflamasomas en macrófagos probou o azul de metileno en ambos os sinais. En macrófagos de medula ósea de rato preparados con lipopolisacárido, a nixericina, o ATP e os cristais de urato monosódico induciron, cada un deles, a liberación de IL-1beta e caspase-1, ademais da formación de agregados puntiformes de ASC; o azul de metileno, de 20 a 200 micromolar, reduciu os tres de maneira dependente da dose sen matar as células. A flaxelina e Salmonella para NLRC4, o ADN de dobre cadea e Listeria para AIM2, e o lipopolisacárido introducido por transfección ou E. coli viva para a vía non canónica mostraron o mesmo patrón. O composto por si só non desencadeou a liberación, e as placas de control non mostraron ningún efecto antibacteriano, polo que o resultado corresponde á resposta do hóspede.

Augas arriba medíronse tres intervencións. O superóxido mitocondrial inducido pola rotenona diminuíu co azul de metileno, e tamén diminuíu a liberación de IL-1beta impulsada pola rotenona. A captación de microesferas fluorescentes diminuíu, un resultado compatible cunha redución da fagocitose antes da detección dos cristais. Un indicador controlado polo promotor de NLRP3 con dous sitios de NF-kB mostrou menor actividade co azul de metileno, mentres que un promotor truncado sen eses sitios non respondeu. Nun tubo sen células, o azul de metileno tamén reduciu directamente a actividade da caspase-1 humana recombinante. Engadir o composto só durante a preparación ou só durante a activación seguía reducindo a liberación de IL-1beta, IL-18 e caspase-1, polo que ambos os pasos están implicados.

As probas en ratos concordaron con esta selectividade. Unha dose letal de lipopolisacárido matou os animais de control en cuestión de horas, mentres que o azul de metileno mellorou a supervivencia; a IL-1beta peritoneal diminuíu, pero a IL-6 no mesmo líquido non. Nun modelo de peritonite por Listeria, a IL-1beta peritoneal diminuíu mentres que os recontos celulares totais non cambiaron. Os monocitos humanos THP-1 comportáronse como os macrófagos de rato nos catro tipos de inflamasoma. Un resultado sobre inflamasomas explica a maduración de IL-1beta e IL-18, non a de todas as citocinas; por iso tamén a forma das células inmunitarias do cerebro nos experimentos con microglía e astrocitos responde a unha cuestión diferente da ensamblaxe da armazón.

Vía 2: transcrición de iNOS mediante a unión de NF-kB e STAT1

A sintase inducible do óxido nítrico, ou iNOS, apenas está presente en repouso e transcríbese segundo a demanda. O lipopolisacárido impulsa este proceso principalmente mediante a degradación de IkB-alpha, seguida da fosforilación de NF-kB e da súa entrada no núcleo. O interferón-gamma impúlsao principalmente mediante a fosforilación de STAT1 polas quinases Janus, seguida da entrada de STAT1 no núcleo. Cada factor únese despois ao seu sitio no promotor de iNOS. A actividade enzimática e a indución xénica son puntos de control separados, e un fármaco pode actuar nun deles ou en ambos.

O estudo de 2015 sobre a indución de iNOS en macrófagos e ratos endotoxémicos situou o efecto no ARN mensaxeiro. En células RAW 264.7 e macrófagos primarios de rato, o azul de metileno a 1 micromolar, administrado 30 minutos antes do lipopolisacárido, do interferón-gamma ou de ambos, reduciu a proteína e o mRNA de iNOS ao longo de 8 a 24 horas, con menos nitrito no medio e sen perda de viabilidade. En ratos que recibiron 25 mg por kg de lipopolisacárido, unha única dose de 5 mg por kg unha hora antes reduciu a proteína e o mRNA de iNOS no pulmón, no fígado e no corazón.

O detalle distintivo é o que non cambiou. A degradación de IkB-alpha, a fosforilación de NF-kB, a fosforilación de STAT1 e a acumulación nuclear de ambos os factores mantivéronse intactas. A interrupción produciuse un paso despois: os extractos nucleares mostraron menos unión de NF-kB ao seu elemento de ADN tras o lipopolisacárido e menos unión de STAT1 tras o interferón-gamma; a inmunoprecipitación da cromatina confirmou unha menor ocupación do promotor de iNOS por ambos os factores dentro das células. O factor de necrose tumoral alfa, cuxo promotor tamén utiliza NF-kB, diminuíu igualmente. Os factores activáronse e chegaron ao núcleo, pero uníronse pouco ao seu ADN diana.

Cómpre observar o contraste coa vía 1. Isto refírese á unión dos factores ao ADN, utiliza STAT1 en lugar de STAT3 e mide mRNA, proteína e nitrito en lugar de agregados puntiformes de ASC e fragmentos de caspase-1. O noso mapa das dianas do azul de metileno en modelos celulares mantén este nivel transcricional separado das medicións enzimáticas directas e mitocondriais.

Vía 3: IL-6 sérica e activación de STAT3 nos tecidos

A IL-6 transmite sinais a través da familia de receptores gp130 á cascada das quinases Janus a STAT3. A STAT3 fosforilada dimeriza, entra no núcleo e impulsa programas inflamatorios, mentres que a propia IL-6 é unha diana de NF-kB, polo que ambas forman un bucle de retroalimentación que adoita chamarse eixe IL-6–STAT3. Os indicadores habituais son a IL-6 sérica augas arriba, a proporción de STAT3 fosforilada respecto da STAT3 total e os encimas efectores, como iNOS e COX2, augas abaixo.

O estudo de 2023 en ratos sobre IL-6 e STAT3 tras o lipopolisacárido mediu o eixe en distintos compartimentos. Os ratos machos C57BL/6 recibiron 1 mg por kg de lipopolisacárido ao día durante tres días, con 5 ou 10 mg por kg de azul de metileno 30 minutos despois de cada dose. No terceiro día, a IL-6 sérica era menor nos dous grupos de azul de metileno que co lipopolisacárido só, mentres que a maioría das outras citocinas do panel non cambiaron co tratamento. As proporcións de STAT3 fosforilada respecto da STAT3 total eran menores no córtex, no hipocampo e na pel da orella, con menor tinción microglial de Iba-1, menos iNOS e COX2 e unha perda de peso parcialmente atenuada.

Aquí cómpre facer dúas advertencias. Unha menor IL-6 sérica xunto cunha menor fosforilación de STAT3 nos tecidos é compatible coa modulación do eixe, pero non identifica o nodo principal, xa que unha menor cantidade de citocina augas arriba, unha menor sinalización do receptor ou unha alteración da actividade das fosfatases poderían producir a mesma proporción. Ademais, o peso ao longo de tres días de exposición aguda é unha medición do animal completo, non unha puntuación de síntomas ou de remisión. Engade contexto máis alá dun inmunoblot sen converter un resultado de sinalización nunha afirmación sobre un tratamento. A química diferenciada da regulación redox mitocondrial discorre en paralelo a esta descrición das citocinas e non debe fusionarse con ela.

Comparación das vías: puntos de intervención e indicadores medidos

A táboa impide tres extrapolacións non válidas. Un resultado sobre agregados puntiformes de ASC non demostra un resultado sobre STAT3. Un resultado sobre a unión de STAT1 ao promotor de iNOS non demostra un resultado sobre STAT3, aínda que ambas as proteínas pertenzan á familia STAT. Un resultado sobre a IL-6 sérica non demostra unha redución da ensamblaxe do inflamasoma: no experimento peritoneal, a IL-1beta diminuíu mentres que a IL-6 non. Cada fila precisa o seu propio estímulo desencadeante e indicador medido; por iso, a lectura dos estudos celulares, animais e clínicos sobre o azul de metileno require relacionar cada afirmación co nivel no que se mediu.

Nada disto establece unha dosificación, seguridade ou beneficio nas persoas. Os modelos con lipopolisacárido son estímulos controlados para probar un mecanismo, non réplicas dunha enfermidade crónica, e administrar o composto xunto co estímulo pon a proba a prevención dun cambio inducido, non a reversión dunha enfermidade xa establecida. Manteña esta descrición dos mecanismos separada dos resultados nos pacientes e avalíe calquera afirmación sobre a saúde segundo o estudo en pacientes que a sustenta.