Azul de metileno e ELA: por que os resultados difiren entre modelos experimentais

Se buscas azul de metileno e ELA, atoparás dúas afirmacións que parecen contradicirse. Unha di que o colorante azul protexeu as neuronas en modelos de ELA. A outra di que non fixo nada nun rato con ELA. Ambas citan artigos reais, e ambos os artigos merecen tomarse en serio. A contradición desaparece ao explicitar o concepto detrás de cada experimento: o modelo delimita a afirmación.

Un resultado nun verme é unha afirmación sobre un verme. Un resultado nun peixe en fase larvaria é unha afirmación sobre un peixe en fase larvaria. Ningún dos dous permite afirmar nada sobre un paciente ata que o avale o curso dunha enfermidade nun mamífero. Este artigo compara os dous traballos máis citados para que poidas ver por que as súas respostas difiren.

Os dous experimentos nunha táboa

Mantén esta táboa á vista mentres les. Nela caben todas as diferenzas importantes entre os estudos.

Difiren a xenética, as especies, a vía de administración, o momento de inicio e os criterios de valoración. O xenotipo é só unha das cinco diferenzas, polo que estes dous estudos non poden demostrar que o azul de metileno actúe selectivamente sobre unha vía da ELA. Demostran algo máis limitado, pero aínda útil: unha forte recuperación baixo unha exposición directa temperá en modelos simples non se trasladou ao curso dunha enfermidade nun mamífero con administración oral crónica.

O resultado positivo: que mostrou o estudo en vermes e peixes

No estudo de 2012 en vermes e peixes expresouse TDP-43 ou FUS humana mutante nas neuronas motoras dos vermes e inxectouse ARNm humano mutante en embrións de peixe. Son modelos de proteotoxicidade. Reproducen os efectos tóxicos da proteína mutante sobre o movemento e a forma das neuronas ao longo de días, non o curso completo da ELA humana adulta ao longo de anos.

O tratamento comezou moi cedo. Os vermes creceron en ágar con azul de metileno desde a eclosión. Os embrións de peixe permaneceron nunha solución do fármaco durante a noite a partir das 24 horas tras a fecundación, e o comportamento avaliouse uns dous días despois. Non había unha barreira hematoencefálica entre o fármaco e a neurona como a hai nun mamífero, e non se mediron as concentracións do fármaco no plasma nin no cerebro.

Nesas condicións, os efectos foron grandes e consistentes. Tanto 6 como 60 μM reduciron a parálise dependente da idade nos vermes con TDP-43 e FUS. No día 12 da vida adulta, aproximadamente o 80 por cento dos vermes con TDP-43 non tratados estaban paralizados, fronte a arredor do 10 por cento dos vermes tratados desde a eclosión. Un ensaio sináptico apuntou na mesma dirección: os vermes con TDP-43 eran hipersensibles ao aldicarb, un fármaco que permite avaliar a transmisión neuromuscular, e o azul de metileno achegou a resposta á normalidade. Diminuíu o número de prolongacións de neuronas motoras en dexeneración, co efecto máis claro a 60 μM. Nos peixes, a natación provocada polo contacto mellorou considerablemente e os axóns motores acurtados volveron medrar cara á súa lonxitude normal con 30 ou 60 μM, aínda que a recuperación foi parcial, non completa.

Os datos de estrés oxidativo encaixan cunha interpretación antioxidante. Os vermes e peixes mutantes mostraron indicadores elevados de especies reactivas do osíxeno que diminuíron co tratamento, e os vermes normais expostos ao azul de metileno sobreviviron a unha agresión prooxidante durante moito máis tempo que os non tratados. Pero importan dúas limitacións. Os niveis totais das proteínas mutantes TDP-43 e FUS non diminuíron, e o estudo non cuantificou directamente os agregados proteicos, polo que mostra unha recuperación funcional sen demostrar a eliminación dos agregados. Quen siga como adoitan formularse as hipóteses redox e mitocondriais debe considerar que o mecanismo ten apoio, pero non está confirmado.

O momento de inicio foi o detalle máis esclarecedor. Cando os autores agardaron ata o día 5 da vida adulta para iniciar o tratamento, a taxa de parálise no día 12 foi de arredor do 55 por cento, en lugar de aproximadamente o 10 por cento co tratamento desde a eclosión. O mesmo fármaco, o mesmo verme, a mesma mutación e un efecto moito menor. A exposición profiláctica temperá explicaba gran parte do beneficio aparente.

O resultado nulo: que mostrou o estudo en ratos con SOD1

O estudo de 2011 en ratos formulou unha pregunta máis esixente nun sistema máis rigoroso. Os ratos conxénicos SOD1 G93A progresan desde o tremor das extremidades posteriores ata a alteración da marcha e a perda do reflexo de endereitamento, ata chegar a un criterio terminal predefinido. O tratamento comezou antes dos síntomas, no día 45, e continuou diariamente, mentres os observadores puntuaban o estado neurolóxico nunha escala de 0 a 6. Este experimento abrangue todo o curso da enfermidade, o que o achega máis ao que lle importaría a un paciente que calquera curva de parálise nun verme.

Os resultados principais foron nulos. O inicio global produciuse aos 121 días nos controis, fronte aos 124 días co azul de metileno, unha diferenza que non foi significativa. A supervivencia ata a fase terminal foi de 167 días fronte a 170 días, tampouco significativa. Algunhas análises secundarias favoreceron o tratamento: as femias mostraron un atraso de arredor de 7 días no inicio, e os animais tratados pasaron algo máis de tempo nas fases máis leves e menos nas graves. Con subgrupos por sexo pequenos e numerosas comparacións entre fases, esas análises deben interpretarse como xeradoras de hipóteses, non como probas. Non se realizaron recontos de neuronas nin ensaios de agregación de SOD1, e tampouco se mediron marcadores oxidativos ou inflamatorios, polo que o estudo non pode determinar se o fármaco chegou ás súas dianas e fallou ou se simplemente nunca actuou sobre elas con esta dose. Só se probou unha dose.

Os propios autores sinalaron a limitación máis profunda, que se aplica en ambas as direccións. O modelo SOD1 G93A cun alto número de copias reproduce ben a enfermidade por toxicidade de SOD1, pero esta representa unha pequena parte da ELA familiar e ten unha bioloxía distinta da maioría dos casos esporádicos. Suxeriron volver probar os compostos candidatos en modelos de mamíferos baseados en TDP-43. Esa suxestión fíxose máis complexa desde entón, porque os autores do estudo en vermes e peixes sinalan que outro estudo do azul de metileno en ratos con TDP-43 tampouco mellorou os resultados motores. Polo tanto, un composto pode mostrar un efecto forte nun sistema con TDP-43 e ningún noutro sistema con TDP-43. O sistema importa tanto como o xene.

Por que a melloría nun verme ou nun peixe non pode demostrar un beneficio nos pacientes

Pensa que cada modelo responde a unha pregunta diferente.

Primeiro, a bioloxía difire. TDP-43 e FUS son proteínas de unión a ácidos nucleicos con interaccións xenéticas compartidas nestes sistemas simples, mentres que a toxicidade de SOD1 actúa mediante mecanismos próximos parcialmente distintos. Un fármaco que alivie un tipo de estrés proteotóxico non ten por que aliviar o outro, e o éxito fronte á sobreexpresión embrionaria non ten por que predicir o éxito fronte á neurodexeneración lenta do adulto con inflamación, participación das células gliais e deterioración sistémica.

Segundo, a exposición difire. A exposición continua por inmersión a concentracións micromolares non equivale á administración oral. A absorción intestinal, o metabolismo de primeiro paso, a unión ás proteínas plasmáticas, a penetración cerebral e a eliminación interveñen entre unha dose inxerida e unha neurona motora da medula espiñal. Ningún dos estudos mediu as concentracións do fármaco no sistema nervioso, polo que ningún pode relacionar a súa concentración coa do outro.

Terceiro, o momento de inicio difire. Os beneficios nos vermes e peixes dependeron en gran medida de iniciar o tratamento antes de que se acumulase dano patolóxico. O tratamento dos ratos tamén comezou antes dos síntomas, o que é unha fortaleza; porén, nos humanos case sempre comezaría despois do inicio dos síntomas, é dicir, aínda máis tarde. Un sinal profiláctico nun ensaio de dous días con embrións é un punto de partida para a investigación, non un modelo de uso clínico.

Cuarto, os criterios de valoración difiren. A parálise aos 12 días, a sensibilidade ao aldicarb, a lonxitude dos axóns en micrómetros e a distancia de natación son fenotipos próximos aos mecanismos estudados. O inicio e a supervivencia nun mamífero integran todos os procesos compensatorios e complicantes do organismo. É habitual que os fármacos modifiquen indicadores próximos sen modificar a supervivencia, e por iso existen os criterios de valoración do tempo ata un evento en mamíferos.

Quen queira unha lista de comprobación para o próximo titular pode tomala de como ler estudos preclínicos: preguntar pola especie, o transxene, a dose e a vía de administración, se se mediron as concentracións do fármaco, cando comezou o tratamento en relación co dano patolóxico, se o criterio de valoración era un fenotipo a curto prazo ou o curso dunha enfermidade e se o efecto se reproduciu nun segundo laboratorio. O conxunto máis amplo de evidencias en humanos sobre o azul de metileno segue sendo o lugar onde comprobar se algún destes sinais temperáns chegou a converterse en datos clínicos.

Que significa isto para os pacientes e as familias

Destes artigos non se deriva ningún protocolo establecido de azul de metileno para a ELA. O estudo positivo apoia continuar investigando os mecanismos oxidativos e sinápticos na bioloxía de TDP-43 e FUS. O estudo nulo vai en contra da expectativa de modificar a enfermidade mediante administración oral crónica con esta exposición na enfermidade de tipo SOD1. Xuntos describen unha inconsistencia entre modelos, non unha recomendación de tratamento.

A seguridade merece o mesmo enfoque prudente que a eficacia. Os estudos de ELA en ratos non din nada sobre doses seguras en humanos, e o azul de metileno entraña riscos reais de hemólise na deficiencia de G6PD e de toxicidade serotoninérxica cando se combina con fármacos serotoninérxicos. A sospeita de deficiencia de G6PD, o uso actual de antidepresivos e calquera cambio previsto na medicación deben abordarse cun profesional clínico, así como a revisión dos datos xerais de seguridade do azul de metileno antes de que ninguén actúe a partir de titulares sobre resultados de laboratorio.

A conclusión cabe nunha frase. O azul de metileno produciu unha forte recuperación dos fenotipos de vermes e larvas de peixe con TDP-43 e FUS baixo exposición temperá, e practicamente ningún beneficio no inicio ou na supervivencia nun estudo de administración oral crónica en ratos con SOD1, polo que a interpretación honesta é que a evidencia depende do modelo e non apoia o seu uso en pacientes.