Qui a développé la coloration violette du sang ? Bleu de méthylène, Malachowski, Romanowsky et Giemsa

L’éosine est rouge. Le bleu de méthylène est bleu. Mélangez les deux, appliquez le mélange sur un frottis sanguin séché, et certaines parties du frottis deviennent violettes.

Pas toutes. Dans une bonne préparation, les noyaux des globules blancs prennent une teinte rouge-violet et, à l’intérieur d’un parasite du paludisme, la chromatine prend la même couleur, tandis que les globules rouges environnants restent roses et que le cytoplasme reste gris-bleu. C’est le violet qui permet de distinguer les différents types cellulaires.

Aucun des deux flacons ne contient de violet. La couleur n’apparaît que lorsqu’un produit de dégradation particulier du bleu de méthylène rencontre l’éosine sur la lame et, dans les années 1880 et 1890, personne ne savait que ce produit existait, encore moins ce qu’il était. Ceux qui cherchaient à obtenir cette couleur travaillaient seuls, avec des colorants impurs, sans aucun moyen fiable de déterminer ce que contenait un flacon après deux mois sur une étagère.

C’est pourquoi la question du titre admet plusieurs réponses défendables, et pourquoi la réponse a changé en 2011.

Un résultat qui changeait avec le mélange

La coloration n’a pas été inventée. Elle s’est construite progressivement. Chaque modification du mélange apportait exactement une nouvelle information visible, et la succession de ces informations est la manière la plus claire de lire cette histoire.

Le motif de la dernière colonne est le plus important. Chaque progrès élargissait la gamme de couleurs, et chaque élargissement rendait visible une structure supplémentaire. Le violet n’est pas un ornement de la technique ; c’est ce qui fait la différence entre constater la présence d’un parasite et voir de quoi il est constitué. Le parcours du colorant lui-même, depuis une usine de colorants BASF jusqu’à la médecine, constitue une histoire plus longue avec ses propres documents. La séquence complète ci-dessus, avec la source correspondant à chaque entrée, est conservée sous la forme d’une chronologie des contributeurs reliée aux sources.

Figure : les mêmes six mélanges représentés selon ce qui se trouvait dans le récipient et ce qui en résultait. Les cercles contiennent les colorants ; les blocs en dessous montrent les couleurs que ces colorants pouvaient produire dans un frottis sanguin. Rien avant 1890 ne fait apparaître de bloc rouge-violet, et rien après cette date ne l’omet.

L’homme qui utilisa volontairement du borax

Ernst Malachowski était un médecin de Breslau, aujourd’hui Wrocław, qui passa sa carrière en cabinet privé et dans une petite clinique qu’il dirigeait avec un collègue, effectuant ses travaux de laboratoire pendant son temps libre. Il naquit à Strzelno le 12 mars 1857, étudia la médecine à l’Université de Breslau et travailla de 1882 à 1887 comme assistant en médecine interne à l’hôpital de la Toussaint, alors le deuxième plus grand hôpital d’Allemagne.

Il commença en 1888 avec la double coloration de Chęciński et Plehn. Dans une préparation réalisée en 1889, il vit que la chromatine du noyau plasmodial se colorait différemment du cytoplasme, puis constata qu’il ne parvenait pas à reproduire le résultat. Il essaya d’acidifier le bleu de méthylène, ce qui aggrava les choses. Il essaya de l’alcaliniser avec du borax, ce qui fonctionna à chaque fois. Il démontra publiquement la méthode le 15 juin 1890 et publia une description plus complète en août 1891, comprenant l’instruction d’utiliser du borax. Il indiqua que la coloration prenait vingt-quatre heures et que les résultats étaient facilement reproductibles.

Vingt-quatre heures, c’est long dans un laboratoire de diagnostic, et son article ne s’attardait pas sur la couleur rouge-violet du noyau du parasite. Quelle qu’en soit la raison, personne ne reprit l’alcalinisation délibérée du bleu de méthylène jusqu’à ce que Nocht le fasse à nouveau en 1898. Malachowski n’écrivit plus jamais sur la coloration sanguine.

Si l’on a su si peu de choses sur lui jusqu’à récemment, la raison est archivistique plutôt que mystérieuse. Presque aucune trace de sa vie ne subsista dans la littérature médicale, et ce qui subsista passa par une seule voie. Sa fille Marie quitta l’Allemagne pour Londres en 1939, servit dans l’armée britannique et s’installa au Canada, et sa collection de papiers familiaux finit au Leo Baeck Institute de New York. Son frère Leo fut tué pendant la Première Guerre mondiale. Sa sœur Eva fut déportée de Breslau vers le camp de transit d’Izbica en avril 1942 et ne revint jamais. Sa mère Hedwig mit fin à ses jours le 22 avril 1942 plutôt que d’attendre la même déportation. Malachowski était mort en 1934, avant tout cela.

Une histoire familiale qui se termine ainsi est une histoire familiale qui cesse d’être citée. Les deux articles qui ont réintégré Malachowski dans l’histoire du développement de la coloration, tous deux publiés en 2011, ont été constitués à partir de documents d’archives à Poznań et Wrocław ainsi que des papiers de Marie à New York.

Un flacon moisi et un Russe chanceux

Dmitri Romanowsky étudia la médecine à l’Académie médico-militaire de Saint-Pétersbourg et travailla sur le paludisme pendant la majeure partie de sa carrière. En 1890, il publia une méthode qui, sur le papier, était presque identique à celle de Chęciński : bleu de méthylène non modifié et éosine, avec un peu plus d’éosine.

En septembre 1891, il publia la méthode qui fit sa renommée, et le détail décisif était enfoui dans les instructions. Ses meilleurs résultats provenaient de die vorräthige Methylenlösung, une solution mère de bleu de méthylène restée plus de deux mois au repos avec de la moisissure qui s’y développait. La moisissure et le temps de repos avaient partiellement déméthylé le colorant. Romanowsky l’ignorait et ne pouvait pas maîtriser ce phénomène, et les autres chercheurs qui essayèrent sa méthode ne parvinrent pas à obtenir le violet. Sa thèse avait été déposée à Saint-Pétersbourg en juin 1891, raison pour laquelle le récit traditionnel retient 1891 comme année de la découverte.

La démonstration de Malachowski avait eu lieu en juin 1890, plus d’un an auparavant, et sa méthode fonctionnait volontairement.

Pourquoi l’éponyme fut attribué au mauvais homme

Le dossier en faveur de Malachowski a été constitué par Kristine Krafts, Ernst Hempelmann et Barbara Oleksyn, et repose sur quatre éléments. La date de la démonstration publique : juin 1890 contre septembre 1891. Le caractère délibéré opposé au caractère fortuit. Le fait que Malachowski ait publié sa méthode, borax compris, tandis que celle de Romanowsky dépendait d’une variable non maîtrisée. Et le constat que la description du noyau plasmodial, ainsi que du violet qui le révélait, disparut pratiquement de la littérature pendant sept ans, parce que personne ne parvenait à reproduire la version accidentelle.

Ils sont catégoriques dans leur conclusion. Dans l’article biographique, ils qualifient cette attribution de « travestissement », et citent Ralph Lillie, qui écrivait en 1978 que « peut-être devrions-nous désigner cette famille de colorations comme les colorations de Malachowski ».

La revendication est contestée, comme le sont généralement les revendications de priorité, et il est plus utile d’expliquer la forme de cette controverse que de la trancher. Un débat sur la priorité doit d’abord définir ce qui constitue la découverte. Si la découverte est la couleur violette, Malachowski dispose de la première démonstration documentée. Si la découverte est la méthode publiée, les deux hommes ont publié en 1891 et l’éponyme est revenu à Romanowsky. Si la découverte est l’explication, aucun des deux ne peut la revendiquer, car aucun ne savait que le mûrissement correspondait à une déméthylation et aucun ne pouvait expliquer pourquoi la couleur apparaissait. C’est ce dernier point que les récits populaires omettent. Le principe actif était une impureté que personne n’avait identifiée, et le premier à produire volontairement la couleur le fit grâce à une recette empirique reproductible, et non parce qu’il comprenait ce que cette recette produisait.

Les deux articles de 2011 constituent l’exposé publié le plus complet du dossier en faveur de Malachowski, et tous deux sont librement accessibles sur PubMed : la longue revue à PMID 21235291 et l’article biographique à PMID 21660627. La notice PubMed de la revue répertorie également un commentaire publié dans la même revue plus tard cette année-là, à 86(5):366, ce qui rappelle à juste titre que l’argument a été contesté dans la littérature dès sa publication.

Le désaccord ne porte pas sur la chimie. Toutes les personnes concernées s’accordent sur ce qu’est le violet et sur les composants qui le produisent. Le désaccord porte sur la personne qui l’a obtenu en premier et sur la question de savoir si un accident que personne ne pouvait reproduire peut réellement être considéré comme une découverte.

Ce que les noms ultérieurs ont apporté

Si Malachowski a produit le violet en premier, pourquoi la coloration porte-t-elle les noms de Romanowsky, Wright et Giemsa ?

Parce qu’une coloration qui fonctionne une seule fois entre les mains de son inventeur n’est pas un réactif. Les travaux ultérieurs ont transformé un mélange capricieux en quelque chose qu’un technicien d’un autre pays pouvait utiliser un mardi.

Nocht y arriva par raisonnement. Après avoir échoué à obtenir un résultat fiable avec un simple colorant neutre, il conclut que le violet devait provenir de quelque chose présent dans le bleu de méthylène qui n’était pas du bleu de méthylène, et il se mit à le chercher. Unna avait déjà remarqué que les solutions vieillies de bleu de méthylène coloraient en rouge les granulations des mastocytes et proposé qu’une nouvelle substance se forme à mesure que le colorant mûrissait. Bernthsen avait montré en 1885 que les conditions alcalines retirent des groupes méthyle du bleu de méthylène, et que ces produits sont ce que nous appelons aujourd’hui les azures. Nocht extraya la fraction active au chloroforme et ne put l’appeler que Rot aus Methylenblau, rouge issu du bleu de méthylène ; Michaelis la nomma azure I en 1901. Jenner résolut le problème logistique. La redissolution du précipité de bleu de méthylène et d’éosine dans du méthanol absolu donna une solution unique et stable qui fixait le frottis en même temps qu’elle le colorait et mit fin à la fixation à chaud. Leishman et Reuter combinèrent un colorant polychromé avec un solvant alcoolique et obtinrent à la fois la stabilité et le violet. Wright remplaça une incubation de douze heures à 65 °C suivie de dix jours de repos par une heure dans de la vapeur en circulation. Giemsa cessa complètement de dépendre d’une solution ayant mûri de manière aléatoire, utilisant des quantités mesurées de colorants connus avec du glycérol dans le méthanol afin que le produit résiste à la chaleur tropicale. Il ne publia jamais la méthode de préparation de son azure de méthylène pur. Il le vendit au laboratoire du Dr Grübler à Leipzig, qui le commercialisa sous le nom d’azure I et affirma que seule sa version constituait une authentique coloration de Giemsa.

L’identité de cet azure fait encore débat. Certains considèrent qu’il s’agissait simplement de bleu de méthylène polychromé, d’autres qu’il était riche en Azure B. La réponse émergea d’une guerre. Lorsque les colorants allemands devinrent impossibles à obtenir, une équipe du United States Public Health Service, Ralph Lillie avec Maurice Roe et Aimee Wilcox, constata que la meilleure coloration provenait de trois composants séparés : du bleu de méthylène non modifié, son produit de dégradation déméthylé Azure B, et de l’éosine. Azure B remplaça l’azure I devenu indisponible, et ces trois composants constituent encore aujourd’hui la base de la coloration utilisée pour diagnostiquer le paludisme.

La chimie de l’interaction entre ces trois composants sur une lame constitue une question distincte, traitée sur une autre page. La page sur les rôles des colorants et la chimie des colorations de type Romanowsky explique ce que font respectivement Azure B et l’éosine, et pourquoi leur association produit une couleur qu’aucun des deux ne produit seul. La page consacrée à la microscopie et aux applications de laboratoire traite du côté pratique : ce qu’une préparation donnée permet d’observer et comment déterminer si un produit particulier convient à la méthode que vous comptez utiliser.

La partie de cette histoire qui reste d’actualité

Un détail de cette histoire n’a pas cessé d’être vrai en 1902. Pendant environ cinquante ans, le composant le plus important de la coloration standard mondiale contre le paludisme fut une impureté sans nom. Elle était présente par accident, sa quantité variait d’un flacon à l’autre, son identité fut pendant une partie de cette période un secret commercial, et sa proportion fit débat jusque dans les années 1940. Les personnes qui utilisaient la coloration n’étaient pas négligentes. Elles n’avaient aucun moyen de savoir ce que contenait le flacon.

La version moderne du même problème est une spécification qui ne décrit qu’une partie du matériau. La conformité USP est la voie vers la pureté la plus élevée offerte par le marché, car il s’agit d’une norme publiée complète plutôt que d’une mesure unique : identité, pureté, impuretés organiques comprenant les colorants azurés, solvants résiduels, impuretés élémentaires, résidu après calcination, limites microbiennes et endotoxines bactériennes. Blupreme obtient son bleu de méthylène auprès d’un fabricant pharmaceutique et publie le certificat d’analyse complet, afin que chaque ligne de cette liste puisse être vérifiée plutôt que simplement affirmée. Un certificat qui indique un résultat concernant les métaux lourds et le présente comme une conformité USP est l’équivalent actuel d’un flacon portant l’étiquette « bleu de méthylène mûri » : peut-être un excellent réactif, mais l’étiquette ne vous dit pas ce qu’il contient.