Lecture de l’apparence des colonies d’E. coli et d’autres bactéries sur gélose EMB

Un étudiant ensemence par stries un échantillon inconnu sur une gélose à l’éosine et au bleu de méthylène, l’incube pendant la nuit, puis retrouve une boîte présentant des colonies foncées avec un reflet vert. Dans le cahier de laboratoire, il écrit « E. coli, confirmé ». Cette note affirme davantage que ce que la boîte permet d’établir. La boîte montre un phénotype de croissance et de fermentation dans des conditions précises. L’identité de l’espèce constitue une affirmation distincte qui nécessite des éléments de preuve distincts.

Ce guide aborde les résultats sur gélose EMB comme un exercice d’interprétation. Il explique le principe sous-jacent, présente un atlas illustratif de boîtes avec contrôles et décrit les situations dans lesquelles l’image classique des manuels peut induire en erreur.

Le principe de la gélose

La gélose EMB est à la fois sélective et différentielle. Les colorants éosine Y et bleu de méthylène inhibent de nombreux organismes Gram positifs, de sorte que le milieu favorise la croissance des Gram négatifs. Ces mêmes colorants servent d’indicateurs : lorsqu’un organisme fermente le sucre disponible et produit suffisamment d’acide localement, la colonie fixe fortement les colorants et devient violet foncé à bleu noir. En cas de forte production d’acide, la surface de la colonie peut présenter une iridescence vert métallique. Le protocole ASM relatif aux boîtes de gélose à l’éosine et au bleu de méthylène décrit cette combinaison de sélection et de différenciation et fournit des photographies de référence à des fins pédagogiques.

Un détail doit être vérifié avant d’interpréter tout résultat : la formulation utilisée. L’ancienne formulation Holt Harris Teague contient du lactose et du saccharose, tandis que la gélose EMB de Levine contient uniquement du lactose. Un organisme qui fermente le saccharose mais pas le lactose, comme de nombreux isolats de Serratia marcescens, peut présenter un aspect différent selon les deux versions. La documentation du fabricant concernant les milieux EMB indique explicitement cette différence de formulation. Consignez le fabricant et la formulation dans le cahier de laboratoire avec le résultat.

Une gélose EMB préparée et non inoculée est généralement brun rouge à violet rougeâtre, parfois avec une teinte verdâtre ou un fin précipité. Cette couleur de fond ne correspond pas à une croissance. Comparez chaque lecture à une boîte non inoculée ou à la référence documentée, et lisez la boîte primaire après environ 18 à 24 heures d’incubation aérobie à 35 à 37 C, sauf indication contraire du protocole pédagogique. Une incubation prolongée peut modifier l’apparence liée à la fermentation.

Comment observer la boîte

Utilisez deux types d’éclairage. Examinez d’abord la boîte sous une lumière réfléchie ou oblique et inclinez-la : le reflet métallique est iridescent et peut apparaître ou disparaître selon l’angle d’observation. Examinez-la ensuite en lumière transmise afin d’évaluer la couleur des colonies et la présence de centres foncés. Travaillez à partir de colonies bien isolées, car une forte densité et les colonies voisines modifient l’accumulation locale d’acide et peuvent atténuer ou accentuer la coloration. Le jeu d’images de l’ASM le montre directement : E. coli en culture mixte peut perdre son reflet attendu parce que les organismes environnants modifient l’environnement acide.

Incluez des contrôles chaque fois que l’exercice le permet. Un ensemble pédagogique courant comprend E. coli ATCC 25922 pour le phénotype bleu noir avec reflet métallique, un non-fermentant tel que Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ou Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 pour le phénotype incolore, et un Gram positif tel qu’Enterococcus faecalis ou Staphylococcus aureus comme contrôle d’inhibition, conformément aux tableaux standard de contrôle qualité des milieux EMB. Si le contrôle positif ne présente pas de reflet, suspectez d’abord les conditions d’incubation, la densité des colonies ou la formulation avant de suspecter l’échantillon inconnu.

Atlas illustratif des boîtes

Les boîtes ci-dessous sont des illustrations générées, et non des photographies de cultures réelles. Elles montrent le motif à rechercher, et non la teinte exacte d’une souche donnée. Comparez-les aux photographies de référence de l’ASM ainsi qu’aux véritables boîtes du laboratoire d’enseignement.

Boîte 1 : Escherichia coli sur gélose EMB, fermentation vigoureuse du lactose

E. coli sur gélose EMB est généralement violet foncé à bleu noir, souvent avec un centre foncé et un reflet vert métallique résultant d’une forte production d’acide. Ce reflet est le signe bien connu que les étudiants recherchent, mais il doit être considéré comme un élément en faveur de l’identification plutôt que comme une définition. L’intensité du reflet varie selon la souche, la durée d’incubation, la densité des colonies et l’angle d’observation. L’absence de reflet n’exclut pas E. coli, et une colonie foncée sans reflet peut correspondre à plusieurs autres organismes fermentants. Prélevez une colonie bien isolée pour tout travail de suivi plutôt que d’interpréter une zone densément ensemencée.

Boîte 2 : Klebsiella pneumoniae sur gélose EMB, fermentant mucoïde

Klebsiella pneumoniae sur gélose EMB forme généralement de grandes colonies brillantes et mucoïdes, dans des teintes rose violet à brun violet, souvent avec des centres foncés mais habituellement sans reflet métallique prononcé. Une morphologie similaire peut être observée chez des organismes fermentants apparentés tels qu’Enterobacter. La texture mucoïde et la taille de la colonie font partie de l’interprétation : une petite colonie rose et plate n’a pas la même signification qu’une grande colonie bombée et mucoïde. Comme pour E. coli, la boîte indique un phénotype de fermentation, tandis que l’identification au niveau de l’espèce nécessite la confirmation biochimique décrite ci-dessous.

Boîte 3 : Salmonella sur gélose EMB et autres non-fermentants, colonies incolores

Salmonella sur gélose EMB et les organismes apparentés ne fermentant pas le lactose, notamment Shigella et de nombreux isolats de Pseudomonas, forment généralement des colonies incolores à translucides ou de couleur ambre pâle. Certaines formulations et conditions peuvent produire une légère teinte rosée ; une colonie rose pâle n’est donc pas automatiquement un organisme fermentant. La gélose EMB ne permet pas de distinguer Salmonella de Shigella ni d’autres non-fermentants ; cette distinction relève de tests ultérieurs. Il convient également de noter que des souches de Salmonella positives pour le lactose présentant des colonies métalliques semblables à celles d’E. coli ont été documentées, ce qui constitue une raison supplémentaire pour laquelle une seule boîte ne permet pas de conclure définitivement.

Boîte 4 : Serratia marcescens et le piège de la formulation

Serratia marcescens mérite une section distincte, car les étudiants s’attendent souvent à des colonies rouges et interprètent ensuite mal la boîte. La plupart des isolats cliniques ne fermentent pas le lactose ; sur gélose EMB de Levine, ils apparaissent donc souvent pâles à faiblement colorés. Comme de nombreux isolats fermentent le saccharose, une formulation contenant du saccharose peut produire une réaction plus foncée ou davantage associée à la production d’acide. Il ne faut pas non plus s’attendre au pigment rouge classique, la prodigiosine, à 35 à 37 C ; la production de pigment est peu fiable à la température de l’incubateur. Lorsque le protocole mentionne Serratia marcescens sur gélose EMB, vérifiez quelle formulation est supposée. Une revue du métabolisme de Serratia résume le profil lactose négatif et variable pour le saccharose à l’origine de ce piège.

Boîte 5 : contrôles et organismes inhibés

Les organismes Gram positifs tels que Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus et Bacillus sont généralement inhibés ou fortement supprimés sur gélose EMB, bien que cette inhibition ne soit pas absolue pour toutes les souches. Un ensemble de contrôles permet une interprétation rigoureuse : le contrôle E. coli doit présenter une bonne croissance avec une coloration bleu noir et un reflet, le contrôle non-fermentant doit présenter une croissance incolore, et le contrôle d’inhibition doit présenter peu ou pas de croissance. Si le contrôle d’inhibition se développe abondamment, l’étape sélective a échoué et toutes les autres interprétations de ce lot deviennent suspectes. Les méthodes de coloration répondent à une question différente de celle des milieux de culture ; pour l’aspect concernant la coloration sur lame au laboratoire, consultez l’atlas de coloration au bleu de méthylène.

Comparaison délimitée

Trois phrases résument les apparences trompeuses. Une colonie foncée ne signifie pas nécessairement E. coli, car Klebsiella, Enterobacter et d’autres organismes fermentants développent des centres foncés sans reflet. Une colonie rose ne signifie pas nécessairement Klebsiella, car des organismes à fermentation modérée ou lente ainsi que certains organismes nominalement non fermentants peuvent apparaître roses ou lavande. Un reflet ne constitue pas une identification définitive d’E. coli, car d’autres organismes à fermentation vigoureuse peuvent également le produire. Le protocole pédagogique et ses illustrations de cultures mixtes montrent chacun de ces pièges.

Limites de la confirmation

La gélose EMB met en évidence un phénotype, et non une espèce. Différents organismes peuvent partager une même apparence coloniale, et un même organisme peut s’écarter de son aspect classique décrit dans les manuels selon la souche, l’âge, la densité des colonies, la formulation et l’incubation. C’est pourquoi les procédures pédagogiques et cliniques considèrent la morphologie sur EMB comme présomptive.

Une démarche rigoureuse pour un étudiant consiste à décrire la colonie isolée (taille, couleur, centre, reflet sous lumière oblique, caractère mucoïde), à consigner la formulation, la durée et la température d’incubation ainsi que les contrôles, puis à repiquer une colonie bien isolée afin d’obtenir une culture pure avant tout test de confirmation. Les étapes de suivi courantes comprennent la coloration de Gram associée aux réactions IMViC pour l’identification présomptive d’E. coli et des coliformes, le TSI ou KIA ainsi que des panels biochimiques spécifiques de l’organisme pour les bactéries entériques, avec une identification sérologique, par MALDI TOF ou par une autre méthode validée lorsque la tâche l’exige. Pour comprendre comment la gélose EMB s’intègre parmi les milieux sélectifs et différentiels destinés aux bactéries entériques, consultez des introductions aux milieux de culture entériques et au suivi par coloration de Gram. Pour la question connexe de ce qu’une coloration bleue sur lame peut ou ne peut pas démontrer, l’atlas de coloration au bleu de méthylène maintient, dans le même esprit, une distinction claire entre observation et conclusion.

Consignez l’observation avant la conclusion. « Colonies bleu noir foncé avec reflet vert dépendant de l’angle sur gélose EMB de Levine à 24 heures, compatible avec une fermentation vigoureuse du lactose » est une formulation défendable. « E. coli, confirmé » exige l’étape de confirmation que la boîte seule ne peut pas fournir. :::