Metyleenisinivärjäys: mikroskopiamenetelmät ja aitojen kuvien atlas

Metyleenisinivärjäys helpottaa muuten heikosti näkyvien solurakenteiden erottamista kirkaskenttämikroskopiassa. Se voi auttaa opiskelijoita paikantamaan poskisolun tuman tai tarkastelemaan mikro-organismien ääriviivoja ja ryhmittymistä. Sininen kohde on kuitenkin havainto. Eliön nimeäminen, sen mittaaminen ja sen arvioiminen, viittaako se sairauteen, ovat erillisiä tehtäviä.

Kansikuva havainnollistaa kontrastin periaatetta. Alla oleva atlas sisältää aitoja valokuvia toisistaan riippumattomasti dokumentoiduista näytteistä alkuperäisine lähdetietoineen.

Mitä metyleenisini tuo näkyviin?

Metyleenisini on emäksinen väriaine: sen värillinen ioni on positiivisesti varautunut. Kuten OpenStax selittää näytteiden värjäystä käsittelevässä osiossaan, emäksiset väriaineet vuorovaikuttavat negatiivisesti varautuneen solumateriaalin kanssa ja voivat saada solut erottumaan vaaleammasta taustasta. Soveltuvissa preparaateissa metyleenisini korostaa runsaasti nukleiinihappoja sisältäviä alueita ja muita väriainetta sitovia rakenteita.

Yksinkertaisessa värjäyksessä kontrasti tuotetaan yhdellä väriaineella. Siksi useat eri eliöt voivat näyttää sinisiltä olematta samaa eliötä. Hyödylliset kysymykset ovat aluksi kuvailevia: ovatko kohteet pyöreitä vai pitkänomaisia, erillään vai ryhmissä, tasaisesti värjäytyneitä vai sisäisesti eriytyneitä? Tutustu yksinkertaisen värjäyksen ja Gram-värjäyksen eroon ennen kuin tulkitset värin luokittelutulokseksi.

Kontrasti ja erotuskyky ovat eri asioita. Kontrasti auttaa erottamaan kohteen ympäristöstään; erotuskyky erottaa lähekkäiset yksityiskohdat toisistaan. Tummempi kuva ei takaa, että rakenteet erottuvat paremmin. Myöskään jokaista tummaa jyvästä ei pidä nimetä soluelimeksi.

Natiivipreparaatit, värjätyt märkäpreparaatit ja sivelypreparaatit

Värjäämätön eli natiivi märkäpreparaatti säilyttää näkymän ilman lisättyä väriainetta, vaikka näytteen poistaminen alkuperäisestä ympäristöstään muuttaa sitä silti. Värjätyssä märkäpreparaatissa reagenssi lisätään materiaalin ollessa nesteessä peitinlasin alla. Kiinnitetyssä sivelypreparaatissa materiaali levitetään objektilasille ja kiinnitetään määritellyllä menetelmällä ennen jatkokäsittelyä. OpenStaxin yleiskatsaus preparointiin erottaa märkäpreparaatit kiinnityksestä ja selittää, miksi kiinnitettyjen eliöiden normaalia liikettä tai aineenvaihduntaa ei enää voida havainnoida.

Nämä preparaatit vastaavat eri kysymyksiin:

Opetuksessa tehtävää vertailua varten dokumentoi värjäämätön preparaatti ennen kuin tutkit erillistä, opetusohjeen mukaisesti värjättyä preparaattia. Pidä valaistus- ja kuvausasetukset vertailukelpoisina. Jos kuvaat kaksi eri solua, kuvaile niitä esimerkeiksi, älä yhden solun ennen–jälkeen-kuvasarjaksi.

Mikroskopia-atlas: kolme aitoa värjättyä näytettä

Tämä atlas on oma valikoimamme ja tulkintamme kolmesta avoimesti lisensoidusta mikroskooppikuvasta. Lähteiden tekijät ilmoittavat näytteet ja värjäykset. Emme ole varmentaneet heidän näytteitään riippumattomasti. Kuvat on toistettu rajaamattomina, häviöttöminä WebP-muunnoksina ilman lisättyjä piirteitä tai värimuutoksia.

Kuvataulu 1: ihmisen poskisolut

Näyte: ihmisen poskisolut. Värjäys: metyleenisini. Suurennus: 400×, kuvaajan ilmoittama. Mittakaavajana: ei saatavilla; lähde ei ilmoita kalibroitua pikselikokoa. Valokuva: Fritzmann2002, 2017, lähteestä Ihmisen poskisolut (metyleenisinivärjäys), lisenssi CC BY-SA 4.0. Tämä toisinto säilyttää saman lisenssin.

Aloita erillään olevasta solusta: sen tummempi tuma on helpompi erottaa ympäröivästä sinisestä solulimasta. Tarkastele sitten sen alapuolella olevia päällekkäisiä soluja. Päällekkäisyys vaikeuttaa rajojen seuraamista ja voi muodostaa paikallisesti tummemman alueen. Harjoittele tämän kuvataulun avulla ääriviivojen seuraamista sen sijaan, että laskisit jokaisen tumman läiskän tumaksi. Poskisolujen havainnointiopas syventää tätä näytekohtaista harjoitusta.

Kuvataulu 2: sipulin solut

Näyte: sipulin solut, lähteen tunnistuksen mukaan. Värjäys: metyleenisini. Suurennus: ”200x” esiintyy alkuperäisessä tiedostonimessä; sitä ei ole varmennettu riippumattomasti. Mittakaavajana: ei saatavilla; kalibrointitietoja ei ole annettu. Valokuva: Alvy16, 2019, lähteestä Sipulin solu 200x, lisenssi CC BY 4.0.

Pitkänomaiset lokerot muodostavat järjestäytyneen kerroksen. Vertaa niiden pitkiä yhteisiä rajoja kuvataulun 1 epäsäännöllisiin ääriviivoihin. Huomaa myös silmiinpistävä tumma materiaali ja näkökentän epätasainen kirkkaus. Valokuva ei osoita, mitä jokainen tumma kertymä on. Se havainnollistaa, miksi hyödylliseen havaintomuistiinpanoon kirjataan myös artefaktit ja epävarmuus sen sijaan, että kaikki värjäytyvä nimettäisiin.

Kuvataulu 3: lähteen Candida spp. -nimellä tunnistama hiiva

Näyte: Candida spp., kuvaajan mukaan. Värjäys: yksinkertainen positiivinen värjäys metyleenisinillä. Suurennus: ei saatavilla. Mittakaavajana: ei saatavilla; kalibroitua pikselikokoa ei ole annettu. Valokuva: Marta, Wikimedia-käyttäjä Martunia.g, 2021, lähteestä Positiivinen värjäys metyleenisinillä 2, lisenssi CC BY 4.0.

Vertaa tiheitä sinisiä ryhmiä väljempiin reuna-alueisiin. Yksittäisiä ääriviivoja on helpompi seurata siellä, missä kohteet ovat vähemmän päällekkäin. Nimi Candida on peräisin lähteen tiedoista, ei tästä valokuvasta tehdystä lajintunnistuksesta. Tämä kuvataulu ei myöskään anna elinkykyä koskevaa tulosta. Hiivan elinkyky- ja hengitysmääritykset edellyttävät omia olosuhteitaan, kontrollejaan ja tulkintaansa.

Mittakaavan oikea tulkinta

Nämä kuvataulut soveltuvat visuaaliseen vertailuun, eivät mikrometreinä tehtäviin mittauksiin tai solujen absoluuttisen koon vertailuun kuvataulujen välillä. Ilmoitettu suurennus ei korvaa puuttuvaa kameran kalibrointia. Kuvan näyttökoon muuttaminen muuttaa sen näennäistä suurennusta.

Kalibroi omien kuviesi mittaukset tunnetun mittastandardin ja käytettävän optisen kokoonpanon avulla. Nikonin mikrometriaopas selittää, miten objektilasimikrometrillä muunnetaan kuvan tai mitta-asteikon mielivaltaiset jaot fyysisiksi pituuksiksi. Kirjaa objektiivi, kamerakokoonpano ja kalibrointi sekä lisää mittakaavajana näiden tietojen perusteella. Älä päättele janaa oppikirjan ilmoittamasta keskimääräisestä solukoosta.

Vastaako pullon sisältö menetelmän vaatimuksia?

Metyleenisiniksi merkitty pullo ei ole täydellinen laboratoriospesifikaatio. Tarkista pitoisuus ja sen yksiköt, liuotin, muut ainesosat, käyttötarkoitus, eräkohtainen dokumentaatio ja ohjeet. Reagenssin käyttöturvallisuustiedote kuvaa vaarat; menetelmäohjeet määrittävät, miten sitä käytetään aiottuun preparointiin.

Konkreettinen esimerkki on Merckin Löfflerin metyleenisini-liuos. Valmistaja määrittelee sen mikroskopiareagenssiksi ja kuvaa sen tehtävän vastavärinä haponkestävyysvärjäyksessä. Myös sen ilmoitettu syttyvyys osoittaa, miksi ”sininen neste” ei ole riittävä tieto käsittelyn tai kuumentamisen suunnitteluun. Nämä ominaisuudet koskevat kyseistä koostumusta, eivät automaattisesti kaikkia metyleenisinin vesiliuoksia.

Samoin eosiini-metyleenisiniagar on koostettu kasvatusalusta. Se ei ole näytteen värjäys, joka tehdään lisäämällä pelkkää metyleenisiniä objektilasilla olevaan näytteeseen. Jos kuvantamisen tavoite on toinen, vertaile metyleenisinille vaihtoehtoisia mikroskopian väriaineita.

Aloittelijan mikroskooppipaketin kanssa aloita sen dokumentoidusta opetusmenetelmästä, tunnetuista valmispreparaateista ja ohjeessa määritellystä reagenssista. Jos pullosta puuttuu etiketti tai sen koostumusta ei voida selvittää, korvaa se asianmukaisella dokumentoidulla reagenssilla. Käytä silmiensuojaimia ja noudata kyseisen koostumuksen mukana toimitettuja käsittelyohjeita. Ihmisperäinen materiaali ja tuntemattomat ympäristönäytteet edellyttävät opetuslaboratorion näytteenkäsittely- ja hävittämismenettelyjä; värjäys ei korvaa näitä menettelyjä.

Kirjaa havainto ennen johtopäätöstä

”Sinisiä soikeita kohteita ryhmissä” on perusteltu kuvaus kuvasta. ”Tietty infektio” edellyttää näyttöä, jota kuva ei ole antanut. Pidä näytteen alkuperä, preparointi, värjäysreaktio ja tunnistusmenetelmä erillään muistiinpanoissa. Tämä erottelu tekee yksinkertaisesta opetuskäyttöön tarkoitetusta kuvasta hyödyllisen ja estää näyttävän mikroskooppikuvan käyttämisen sellaisen väitteen tukena, jota se ei voi perustella.