Miten metyleenisininen pääsee soluihin: pelkistyminen, uudelleenhapettuminen ja jakautuminen kalvoon

Kun seuraat metyleenisinisen siirtymistä viljelymaljan endoteelisoluihin, ilmeisin tulkinta on samalla väärä. Viljelyväliaine menettää sinisen värinsä ja soluihin ilmestyy sinisiä jyväsiä, joten väriaineen on täytynyt kulkea kalvon läpi sinisenä molekyylinä. Kokeet kertovat muuta. Sininen muoto läpäisee kalvon vain heikosti. Kalvon ylittää väritön muoto, ja solun sisällä näkyvä sininen muoto syntyy siellä vasta saapumisen jälkeen.

Tämä päinvastainen tapahtumakulku on tärkeä, sillä se ratkaisee, mitä värjäytyminen voi kertoa ja mitä ei. Siniset jyväset kertovat hapettuneesta väriaineesta, joka on hapettunut uudelleen ja jäänyt soluelinten sisään. Ne eivät kerro solun väriaineen kokonaismäärästä tai pelkistyneen muodon määrästä eivätkä mittaa biologista vaikutusta. Syyn ymmärtämiseksi on seurattava kolmea vaihetta: pelkistymistä solun pinnalla, pelkistyneen muodon diffuusiota sekä uudelleenhapettumista ja pidättymistä solun sisällä.

Kaksi muotoa käyttäytyvät kuin eri molekyylit

Hapettunut metyleenisininen on tasomainen, positiivisesti varautunut rengasrakenne. Se liukenee veteen, absorboi voimakkaasti valoa noin 600–700 nanometrin alueella ja näyttää siniseltä. Ratkaisevaa on varaus. Varautunut, vesihakuinen molekyyli ei kulje helposti lipidikalvon läpi, joten kirjallisuudessa käytetään varovaista ilmaisua suhteellisen huonosti kalvoa läpäisevä, ei kalvoa läpäisemätön.

Pelkistynyt metyleenisininen eli leukometyleenisininen on väritön, varaukseton ja rasvaliukoinen. Kun varaus poistuu, kalvo lakkaa olemasta este. Pelkistynyt molekyyli diffundoituu helposti kalvon läpi. Kun se pääsee hapettavampaan solunsisäiseen tilaan, se voi jälleen luovuttaa elektroneja ja palautua siniseksi, varautuneeksi muodoksi, joka jää sinne. Väriaineen hapetus-pelkistyskemia on siis myös sen kuljetusmekanismi. Elektronimäärän muuttuessa myös läpäisevyys muuttuu.

Ensimmäisen vaiheen elektronit tulevat solusta itsestään. Nisäkässolut kuljettavat elektroneja solukalvon läpi ja siirtävät pelkistäviä ekvivalentteja solunsisäisiltä luovuttajilta solun pinnalla oleville vastaanottajille. Tämä solukalvon läpi tapahtuva toiminta on normaali solutoiminto, jota esiintyy useimmissa solutyypeissä. Tiatsiiniväriaineita käsittelevä endoteelin pinnan reduktaasi käyttäytyy muiden vastaavien entsyymien tavoin yhdessä paljastavassa suhteessa: se jatkaa toimintaansa syanidin ja atsidin läsnä ollessa sellaisilla pitoisuuksilla, jotka pysäyttävät myöhemmät vaiheet. Tämä vaiheiden erottaminen on koko selityksen ydin.

Jakautuminen oli ensimmäinen selitys, ja se lähes selitti soluunoton

Vuonna 1929 Marian Irwin Rockefeller-instituutista esitti yksinkertaisemman kysymyksen. Ehkä väriaineen pääsy soluun on vain jakautumista veden ja solun rasvamaisten kerrosten välillä, ja kloroformikerros voisi edustaa näitä rasvakerroksia laboratoriokokeessa. Hänen spektrofotometrisissä läpäisytutkimuksissaan väriaineen vesiliuoksia ravisteltiin kloroformin kanssa ja orgaaniseen faasiin siirtynyttä ainetta verrattiin elävien leväsolujen sisään päätyneeseen aineeseen.

Kaksi tuon työn havaintoa ansaitsee edelleen huomiota. Ensinnäkin kaupalliset metyleenisiniliuokset sisälsivät trimetyylitioniinia, jota kutsutaan nykyisin nimellä Azure B. Tämä epäpuhtaus tunkeutui soluihin nopeammin kuin metyleenisininen itse, erityisesti emäksisessä pH:ssa, jossa rasvaliukoinen vapaa emäsmuoto on vallitseva. Osa metyleenisinisen näennäisestä soluunotosta olikin todellisuudessa Azure B:n valikoivaa soluunottoa. Toiseksi pH määräsi lopputuloksen määrittämällä ionisaatiotilan, ja vaurioituneisiin soluihin pääsi paljon enemmän väriainetta kuin ehjiin. Jakautumiskertoimet ja varaustila määräsivät, mitä keinotekoinen järjestelmä ja elävä solu kumpikin ottivat sisäänsä. Näiden kahden samankaltaisuus tuki ajatusta solun rajalla olevista vedettömistä kerroksista.

Malli ennakoi oikein lipidien ja ionisaation merkityksen, mutta se ei kyennyt erottamaan sellaisenaan jakautuvaa väriainetta sellaisesta, joka muuttuu kemiallisesti solun pinnalla, ylittää kalvon toisessa muodossa ja muuttuu takaisin solun sisällä. Tämän eron selvittämiseen tarvittiin toisenlainen koe, joka tehtiin seitsemänkymmentä vuotta myöhemmin keuhkojen endoteelisoluilla.

Pelkistyminen ulkopuolella, pidättyminen sisäpuolella

Merker ja hänen kollegansa tutkivat viljeltyjä naudan keuhkovaltimon endoteelisoluja ja ehdottivat kolmivaiheista tapahtumaketjua: hapettunut väriaine pelkistyy solun pinnalla värittömäksi lipofiiliseksi muodokseen, pelkistynyt muoto diffundoituu soluun ja solunsisäinen uudelleenhapettuminen palauttaa huonosti kalvoa läpäisevän hapettuneen muodon, joka kertyy soluun. Heidän tutkimuksensa tiatsiinien soluunotosta endoteelissä testasi tätä tapahtumaketjua pyrkimällä katkaisemaan sen tietyistä kohdista.

Ensimmäinen työkalu oli ferrisyanidi, elektronien vastaanottaja, joka ei pääse soluun. Kun pintaentsyymit pelkistävät sinisen väriaineen värittömäksi muodoksi solun ulkopuolella, ferrisyanidi voi ottaa nämä elektronit takaisin ja palauttaa väriaineen siniseksi viljelyväliaineessa jo ennen kalvon ylitystä. Niin kauan kuin ferrisyanidia oli ylimäärin (10 mikromolaarista väriainetta suhteessa 50–500 mikromolaariseen ferrisyanidiin), väriaineen soluunotto lähes pysähtyi. Vasta ferrisyanidin kuluttua loppuun soluunotto jatkui normaalilla nopeudellaan. Kinetiikka kertoi saman asian toisella tavalla. Ferrisyanidi hävisi suunnilleen vakionopeudella, mikä sopi tasaiseen solun pinnan pelkistysvuohon ja kierrätettävään välittäjään. Solunulkoinen väriaine sen sijaan hävisi eksponentiaalisesti sen määrän vähetessä. Vakiona pysyvä vuo ja vähenevä väriainevaranto tarkoittavat, että ferrisyanidisignaali kuvaa jatkuvaa pelkistymistä eikä väriainemolekyylien poistumista liuoksesta.

Toinen työkalu poisti kalvon ylitysvaiheen kokonaan. Tutkimusryhmä liitti toluidiinisininen O:n, läheisen tiatsiinisukulaisen, suureen polyakryyliamidiketjuun, joka oli liian suuri päästäkseen soluun kummassakaan hapetustilassa. Solut pelkistivät silti ketjuun kiinnitetyn väriaineen. Pelkistyminen ei siis edellytä pääsyä solun sisään. Pelkistymisestä vastaava koneisto on esillä solun pinnalla tai sähköisesti kytkeytynyt siihen.

Sitten tehtiin vaiheiden erottelu, johon tutkimuksen otsikko perustuu. Syanidi ja atsidi estivät voimakkaasti väriaineen kertymistä 2 millimolaarisina pitoisuuksina. Mikroskoopissa tavallisesti tumaa ympäröivät tummansiniset ja violetit kertymät katosivat lähes kokonaan. Kumpikaan estäjä ei kuitenkaan hidastanut solunulkoista pelkistymistä: ferrisyanidin kierto jatkui heikentymättä, ja kalvoa läpäisemätön polymeeri pelkistyi edelleen. Esto kohdistui myöhempään vaiheeseen. Syanidi ja atsidi pysäyttivät solunsisäisen uudelleenhapettumisen ja pidättymisen, eivät solun pinnan pelkistymistä. Elinkykykontrollit tukivat tätä tulkintaa, sillä solut säilyttivät sytosolisen merkkientsyyminsä laktaattidehydrogenaasin näiden käsittelyjen aikana. Soluunoton häviäminen ei siis johtunut vain myrkyttymisestä tai kalvon rikkoutumisesta.

Yksi tutkimuksessa esitetty varaus pätee edelleen. Siniset kertymät sijaitsivat tuman ympärillä mutta eivät sen sisällä, mikä sopi hapettumiseen soluelinten sisällä. Tutkimus ei kuitenkaan tunnistanut, mistä soluelimistä oli kyse. Muiden solutyyppien samankaltaisia kuvioita oli kutsuttu lysosomaalisiksi heikon näytön perusteella. Pidättymistä voi pitää osoitettuna, mutta sen tarkkaa sijaintia alustavana tietona. Elektronien seuraavista vaiheista kiinnostuneet voivat jatkaa aiheisiin mitokondrioiden elektroninsiirto ja hapetus-pelkistysreaktiot sekä laajempaan kokonaisuuteen imeytyminen ja jakautuminen antoreitin mukaan.

Värjäytyminen ei ole altistuksen mitta

Kolmas tutkimus osoittaa, mitä tapahtuu, kun tätä soluunoton mekanismia tarkastellaan yhdessä biologisen mittaustuloksen kanssa. Scott ja hänen kollegansa havaitsivat, että metyyli-beeta-syklodekstriini, rengasmainen sokerirakenne, sitoo metyleenisinistä suoraan. Inkluusiokompleksin assosiaatiovakio oli noin 310 yhtä molaaria kohti, kun väriaineen dimerisaation vastaava arvo oli noin 5846 yhtä molaaria kohti. L929-fibroblasteissa tämä sitoutuminen esti sekä solujen värjäytymisen että glukoosinoton tehostumisen: esi-inkubointi syklodekstriinin kanssa esti sinisen värjäytymisen, ja sen lisääminen jälkikäteen nopeutti värin poistumista. Kun optinen sininen signaali poistui soluista, aktivoitunut glukoosinkuljetus heikkeni tiiviisti sen rinnalla.

Kirjoittajat tulkitsivat tämän korrelaation puoltavan väriaineen suoraa vuorovaikutusta glukoosinkuljettajan aktivaatioreitin proteiinin kanssa pitkäkestoisen oksidatiivisen stressimekanismin sijaan. Päätelmä on perusteltu mutta rajallinen. Koe ei nimeä proteiinia eikä osoita sitoutumista itse kuljettajaan. Värin poistumisen ja vaikutuksen häviämisen välinen korrelaatio ei myöskään sulje pois kaikkia hapetus-pelkistysreaktioiden välittämiä reittejä.

Pysyvä opetus koskee mittaamista. Optinen värjäytyminen kuvaa näkyvää, hapettunutta, soluun liittynyttä väriainetta. Väritön pelkistynyt väriaine jää siltä kokonaan havaitsematta, joten vaalea solu voi silti sisältää väriainetta vastaavan määrän ainetta. Voimakkaasti värjäytynyt solu puolestaan kertoo soluun jääneestä hapettuneesta väriaineesta, ei kudoksen kokonaisaltistuksesta tai vaikutuksen suuruudesta. Sama varaus pätee laajemminkin: värjäytymisen vertailu solutyyppien välillä tai tumman kudosleikkeen pitäminen todisteena suuremmasta altistuksesta toistaa viljelymaljan alkuperäisen tulkintavirheen. Soluunotto on pelkistymisen, diffuusion ja uudelleenhapettumisen kierto, ja mikä tahansa yksittäinen kuva sinisestä muodosta näyttää siitä vain yhden osan. Tästä seuraavat suoraan käytännön johtopäätökset laboratoriovärjäykseen ja käsittelyyn sekä annosta ja altistusta koskevien väitteiden tulkintaan.