Metyleenisininen ja suoliston mikrobiomi: hiiritutkimusten näyttö

Metyleenisininen voi muuttaa hiirten ulosteista mitattua bakteeriprofiilia. Tämä havainto ei osoita, että se parantaisi ihmisen suoliston terveyttä, poistaisi valikoivasti haitallisia bakteereja tai hoitaisi dysbioosia. Ratkaiseva ero on mikrobiyhteisön muuttamisen ja sen isännän terveyden parantamisen välillä.

Tämän kysymyksen kannalta olennaisimmassa hiirikokeessa mitattiin bakteerien DNA:ta ja suoriutumista sokkelotehtävässä. Näillä mittauksilla voidaan tunnistaa ilmiöitä, joita kannattaa tutkia tarkemmin. Ne eivät yksinään osoita, että bakteerimuutos aiheutti käyttäytymismuutoksen tai että kumpikaan ennustaisi ruoansulatusoireiden lievittymistä.

Mitä tutkijat todella mittasivat

Gureevin ja kollegoiden vuoden 2020 kokeessa kolmen kuukauden ikäiset C57Bl/6-hiiret saivat neljän viikon ajan metyleenisinistä annoksella 15 mg/kg/day (yhdeksän hiirtä) tai 50 mg/kg/day (kahdeksan), tai vertailuryhmänä vettä (13). Koeasetelmaa kuvaavassa osiossa ei määritellä selvästi lääkkeen antoreittiä eikä eläinten sukupuolta.

Ulostenäytteitä otettiin ennen käsittelyä ja viikoittain. Tutkijat käyttivät bakteeriryhmäkohtaista qPCR-menetelmää ja lisäksi 16S-DNA:n amplikonisekvensointia. Viimeisten viiden päivän aikana hiirillä oli kaksi totuttelupäivää ja niiden jälkeen kolme päivää palkitsemiseen perustuvaa T-sokkelotestausta, jossa pisteytettiin päivittäin kymmenen valintaa.

Nämä ovat hiirikokeissa käytettyjä altistuksia, eivät ihmisille tarkoitettuja annossuosituksia. Antoreitillä on merkitystä arvioitaessa, kuinka paljon lääkettä päätyy suolistoon, eikä ilmoittamatonta antoreittiä pidä olettaa. Painoon perustuva muunnos ei osoittaisi turvallista tai tehokasta käyttöohjelmaa ihmiselle.

Mikrobiomitutkimuksen näyttötaulukko

Tämä artikkelia varten laadittu taulukko erottaa raportoidut havainnot pidemmälle menevistä väitteistä, joita lukija saattaa kohdata. Bakteeriryhmien nimet noudattavat tutkimusartikkelin terminologiaa.

Näytön osa-alue	Havainto tai mittaus	Tulkinnan raja
Pienemmän altistuksen bakteeriprofiili	Annoksella 15 mg/kg/day tietyt ryhmät muuttuivat; Delta/Gammaproteobacteria lisääntyivät aluksi, mutta niitä ei havaittu neljännellä viikolla.	Loppuvaiheen näyte voi jättää aiemmat muutokset havaitsematta. Havaitsematta jääminen riippuu määritysmenetelmästä.
Suuremman altistuksen bakteeriprofiili	Annoksella 50 mg/kg/day Proteobacteria-ryhmän mediaaniosuus oli neljännellä viikolla 7.49%, kun se vertailuryhmässä oli 1.61%.	Prosenttiosuuden kasvu ei osoita elävien solujen absoluuttisen määrän kasvua.
Taksonomiset yksityiskohdat	Sekvensointi tunnisti muutoksia laajojen bakteeriryhmien sisällä.	Pääjakson vakaa kokonaismäärä voi peittää sen jäsenten välisiä muutoksia.
Isännän käyttäytyminen	Pienempi altistus paransi yhdistettyjä T-sokkelopisteitä; suurempi altistus ei.	Kyse on tietyssä tehtävässä suoriutumisesta, ei kattavasta kognition arvioinnista.
Yhteys	Deferribacteres korreloi negatiivisesti toisen päivän pisteiden kanssa.	Korrelaatio ei tunnista syyksi tiettyä eliötä tai mekanismia.
Suoliston toiminta	Ei suoraa suoliston suojakerrosta tai aineenvaihduntatuotteita koskevaa vastemuuttujaa.	Tutkimus ei voi osoittaa läpäisevyyden korjaantumista tai mikrobien toiminnan paranemista.
Syy-yhteyden testaus	Ei mikrobiston siirto- tai vähentämiskoetta.	Se, välittivätkö mikrobit käyttäytymisvaikutuksen, jää ratkaisematta.

Taulukko on tarkoituksella jaettu sen mukaan, mitä mitattiin. Myönteinen vastaus yhdellä rivillä ei voi korvata puuttuvaa vastausta toisella. Esimerkiksi parempi suoriutuminen sokkelotehtävässä ei tuota puuttuvaa näyttöä suoliston tulehduksesta.

Miksi bakteerien prosenttiosuudet eivät osoita, mitä tapettiin

Termi suhteellinen runsaus kuvaa ryhmän osuutta mitatusta yhteisöstä. Se on eri asia kuin bakteerisolujen määrä ulostegrammaa kohti. Vandeputte ja kollegat osoittivat kvantitatiivisessa mikrobiomiprofilointitutkimuksessaan, miksi mikrobien kokonaismäärä on tärkeä yhteisöjen välisiä eroja tulkittaessa.

Tarkastellaan havainnollistavaa näytettä, jossa on kymmenen yksikköä eliötä A ja 90 yksikköä muita eliöitä. A:n osuus on 10%. Jos A:n määrä pysyy kymmenessä mutta muiden määrä laskee 40:een, A:n osuus on nyt 20%. Sen osuus kaksinkertaistui ilman absoluuttisen määrän kasvua. Tämä laskuesimerkki ei ole metyleenisinikokeen tulos.

Sama ero rajoittaa bakteerien tappamista koskevia väitteitä. DNA:han perustuva osuus ei ole suora eloonjäämistesti. Elinkykyisten bakteerien vähenemisen osoittamiseen tarvitaan mittauksia, jotka arvioivat elinkykyä ja huomioivat kokonaispopulaation. Toiminnallisen muutoksen osoittamiseen tarvitaan asiaankuuluva toiminnallinen mittaus, kuten mitattu aineenvaihduntatuote pelkkiin bakteerien nimiin perustuvan ennusteen sijaan.

Laajat luokittelut peittävät myös biologista vaihtelua. Kokonaisen pääjakson luokittelu hyödylliseksi tai haitalliseksi ohittaa tietystä lopputuloksesta vastaavat eliöt ja niiden toiminnan. Suhdeluvun muutos ei siis yksinään ole dysbioosin diagnoosi eikä näyttö siitä, että dysbioosi olisi parantunut.

Selittikö mikrobiomi sokkelotuloksen?

Kokeessa lääkealtistus, bakteeriprofiili ja käyttäytyminen sisällytettiin samaan tutkimukseen. Tästä on hyötyä hypoteesin muodostamisessa. Tulkintamme mukaan koeasetelma ei erota useita mahdollisia selityksiä toisistaan: lääkkeen suoraa vaikutusta käyttäytymiseen, epäsuoraa mikrobien välittämää vaikutusta tai käyttäytymisen ja bakteerien erillisiä vasteita samaan altistukseen.

Vahvemmassa vaikutuksen välittymistä selvittävässä kokeessa oletettua mikrobivälittäjää muutettaisiin lääkkeestä riippumatta. Tutkijat voisivat testata, siirtyykö vaikutus määritellyn yhteisön siirtämisen mukana tai estääkö oletetun mikrobien toimintareitin poistaminen vaikutuksen. Tällaiset kokeet vaativat myös kontrollit sille, mitä muuta siirtyy tai muuttuu.

Käyttäytymistä kuvaavaa vastemuuttujaa on tarkasteltava yhtä huolellisesti. Palkitsemiseen perustuvassa sokkelossa eläin tekee valintoja tietyissä olosuhteissa. Arvioinnissa on lähtökohtaisesti huomioitava, että suoriutumiseen voivat vaikuttaa tutkimishalu, liikkuminen, palkkion tavoitteluun liittyvä motivaatio ja oppiminen. Tuloksen kutsuminen ”paremmaksi kognitioksi” niputtaa nämä erot yhteen. Suoraan mitattu tehtävä on edelleen informatiivisempi kuvaus.

Tappaako metyleenisininen suolistobakteereja?

Metyleenisininen voi osallistua antimikrobiseen toimintaan määritellyissä laboratorio-olosuhteissa. Tämä ei kerro, mitä koko suoliston mikrobiyhteisölle tapahtuu suun kautta tapahtuvan altistuksen jälkeen.

Esimerkiksi bakteerien fotodynaamista inaktivointia käsitelleessä laboratoriotutkimuksessa testattiin E. coli- ja S. aureus -bakteereja valoherkistävillä aineilla ja kontrolloidulla valaistuksella. Tutkimuksessa arvioitiin pesäkkeiden muodostumista ja solukalvovaurioita, ja mukana olivat vastaavat pimeäkontrollit. Pelkkä valo tai valoherkistävä aine ei vaikuttanut testatuissa olosuhteissa.

Nämä kontrollit vastaavat tärkeään syy-yhteyttä koskevaan kysymykseen kyseisessä kokeessa: mikä oli yhdistelmän osuus vaikutuksesta? Aineen nieleminen ei vastaa bakteerisuspension valaisemista. Toisaalta negatiivinen pimeäkontrollin tulos yhdellä pitoisuudella ja altistusajalla ei todista, että jokainen ilman valoa tapahtuva altistus olisi biologisesti vaikutukseton. Antimikrobisen tutkimuksen katsaus selittää näitä olosuhteista riippuvia eroja.

Suoliston mikrobiyhteisöä koskeva tutkimus ei myöskään voi osoittaa tietyn infektion hoitoa. Eliön tunnistaminen ja asianmukaisen kliinisen tuloksen osoittaminen ovat erillisiä tehtäviä, myös arvioitaessa loisten hoitoa koskevia väitteitä.

Mitä tämä tarkoittaa ihmisen suoliston terveyttä koskeville väitteille

Tätä artikkelia varten tehdyssä kohdennetussa kirjallisuushaussa ei löytynyt kontrolloitua ihmisen suoliston mikrobiomia koskevaa tutkimusta, joka osoittaisi metyleenisinisen hyödyttävän suoliston terveyttä. Tämä kertoo löydetystä näytöstä, eikä todista, ettei mitään asiaankuuluvaa tutkimusta ole olemassa. Ihmisillä tehty tutkimus suun paikallisesta fotodynaamisesta hoidosta koskee eri kysymystä: esimerkiksi 45 henkilön pahanhajuisen hengityksen tutkimuksessa otettiin näytteitä kielen katteesta ja mitattiin hengityksen kaasuja, ei suoliston terveyttä.

Ihmisen suoliston terveyttä koskevan väitteen tueksi tutkimuksessa tarvittaisiin määritelty kohderyhmä, toistettavissa oleva valmiste ja antoreitti, sopiva vertailu sekä kyseiselle kohderyhmälle merkityksellinen tulos. Mikrobiprofiili voisi auttaa selittämään tulosta, mutta oireiden lievittymistä, sairauden hallintaa ja haittavaikutuksia olisi silti arvioitava.

Neljä viikkoa yhdessä hiirimallissa ei myöskään voi osoittaa kuukausien tai vuosien käytön seurauksia. Päivittäistä ja pitkäaikaista metyleenisinialtistusta käsittelevä katsaus erottaa hoidon keston seurannasta ja turvallisuutta koskevista vastemuuttujista. Laajempaa kliinistä taustaa varten tutustu siihen, mitä ihmistutkimukset tukevat.