مقاله
متیلن بلو و مولتیپل اسکلروزیس: پژوهش‌های حیوانی چه چیزی را آزمودند
اگر متیلن بلو برای MS را جست‌وجو کنید، به مقاله‌هایی می‌رسید که به نظر می‌رسد به یک پرسش پاسخ می‌دهند. اما چنین نیست. یک مقاله متیلن بلو را به‌عنوان درمان به موش‌های بیمار داد. مقالهٔ دیگر هیچ حیوانی را با آن درمان نکرد. در آن، متیلن بلو به‌عنوان رنگ آبی روی برش‌های نازک نخاع استفاده شد تا آسیب‌شناس بتواند میلین را زیر میکروسکوپ ببیند.
مفهوم محوری این مقاله همین است. این رنگ در زیست‌شناسی دو نقش دارد که جز بطری، هیچ وجه مشترکی ندارند. در نقش یک نامزد دارویی، به حیوان زنده داده می‌شود و پرسش این است که آیا بیماری تغییر می‌کند یا نه. در نقش رنگ بافتی، پس از آزمایش روی بافت مرده و تثبیت‌شده به کار می‌رود و پرسش این است که بافت چه ظاهری داشته است. اگر این تفاوت را نادیده بگیرید، بخش روش‌های آسیب‌شناسی را طوری خواهید خواند که گویی نتیجهٔ یک درمان است.
EAE به زبان ساده چیست
انسفالومیلیت خودایمنی تجربی، که معمولاً به‌اختصار EAE نامیده می‌شود، مدل حیوانی استاندارد برای بررسی برخی جنبه‌های مولتیپل اسکلروزیس است. پژوهشگر یک موش مستعد را با قطعه‌ای از یک پروتئین میلین، همراه با یک ادجوانت قوی، ایمن‌سازی می‌کند. سپس دستگاه ایمنی به دستگاه عصبی مرکزی خود حیوان حمله می‌کند. موش دچار ضعف صعودی می‌شود که به‌راحتی می‌توان آن را در مقیاس 0 تا 5، از شل‌شدن دم تا فلج اندام‌های عقبی، امتیازدهی کرد.
این سهولت امتیازدهی توضیح می‌دهد چرا EAE پرکاربرد است و همچنین چرا می‌تواند گمراه‌کننده باشد. MS در انسان به‌طور خودبه‌خود پدید می‌آید، مجموعه‌ای گسترده‌تر و کمتر مشخص از اهداف را درگیر می‌کند و علائم بینایی، حسی، شناختی، مخچه‌ای و حرکتی را در سیرهای عودکننده یا پیشرونده ایجاد می‌کند. EAE سازوکارهای منتخب، مانند التهاب، میلین‌زدایی و آسیب آکسونی را در شرایط کنترل‌شده بازسازی می‌کند. این مدل نسخهٔ کوچک‌شدهٔ MS نیست. خوانندگانی که به دنبال چارچوب کلی هستند، می‌توانند پیش از ارزیابی هر ادعای مربوط به یک بیماری خاص، دیدگاه‌های موجود دربارهٔ نحوهٔ عملکرد متیلن بلو در سطح سلولی را مرور کنند.
دو مقالهٔ زیر از آنتی‌ژن‌های متفاوتی برای EAE نیز استفاده کردند که نکتهٔ مهمی است. مطالعهٔ درمانی بیماری را با MOG35-55، یک پپتید کوتاه از گلیکوپروتئین میلین الیگودندروسیت، القا کرد. مطالعهٔ آسیب‌شناسی بیماری را با MP4، ترکیبی پیوندی از بخش‌هایی از پروتئین بازی میلین و پروتئین پروتئولیپید، القا کرد. انتخاب سویه و آنتی‌ژن، محل بروز ضایعات و رفتار التهاب را تغییر می‌دهد؛ بنابراین این دو مطالعه، دو بار اجرای یک آزمایش واحد نیستند.
نقشهٔ راه: از مدل به پرسش و محدودیت‌ها
این جدول را پیش چشم نگه دارید. این جدول مرجع اصلی این مقاله است. هر ردیف مشخص می‌کند مدل می‌تواند به کدام پرسش بالینی پاسخ دهد، چه چیزی واقعاً اندازه‌گیری شده و تعمیم به انسان در کجا متوقف می‌شود.
| مطالعهٔ درمانی (MOG EAE) | مطالعهٔ آسیب‌شناسی (MP4 EAE) | |
|---|---|---|
| مقاله | مطالعهٔ درمان EAE ناشی از پپتید MOG | مطالعهٔ طولی آسیب‌شناسی MP4 |
| نقش متیلن بلو | مداخله‌ای که به موش‌های زنده داده شد | رنگی که روی برش‌های تثبیت‌شدهٔ نخاع با ضخامت 1 میکرومتر به کار رفت |
| پرسش بالینی که می‌تواند به آن پاسخ دهد | آیا دادن دارو شدت EAE و پیام‌رسانی ایمنی را تغییر می‌دهد | میلین‌زدایی و آسیب آکسونی طی شش ماه چگونه تغییر می‌کنند |
| شاخص‌های پیامد | امتیازهای بالینی روزانه، ارتشاح سلولی در نخاع، میلین‌زدایی، آسیب آکسونی، پیام‌رسانی AMPK و SIRT1، فعالیت NF-kB، تعادل Th17 در برابر Treg | مساحت ضایعه، درجات التهاب و ادم، تراکم رشته‌های میلین‌زدایی‌شده، نسبت g با میکروسکوپ الکترونی، آکسولیز، تورم میتوکندری، فاصلهٔ میان نوروفیلامنت‌ها |
| محدودیت تعمیم به انسان | یک سویه، یک جنس، دورهٔ کوتاه 30 روزه، همبستگی نه اثبات سازوکار | هیچ درمانی آزموده نشد، نمونه‌برداری مقطعی از بافت، نمونه‌برداری ضایعات عمدتاً از بخش کمری نخاع |
هر کسی که می‌خواهد تیتر بعدی را بررسی کند، می‌تواند با کمک راهنمای خواندن مطالعات پیش‌بالینی همین ستون‌ها را دوباره به کار ببرد: گونه و آنتی‌ژن، نقش ترکیب، شاخص‌های پیامد و اینکه نتیجه بیانگر سیر بیماری است یا تصویری از بافت در یک مقطع زمانی را بررسی کنید.
نتیجهٔ درمان: دادن دارو چه چیزی را تغییر داد
مطالعهٔ درمانی سال 2016 در Journal of Neuroimmunology از موش‌های مادهٔ C57BL/6 با سن حدود 8 تا 10 هفته استفاده کرد که با 250 میکروگرم MOG35-55 برای هر موش ایمن‌سازی شدند. پس از القای بیماری، حیوانات مبتلا به EAE به‌طور تصادفی به گروه متیلن بلو یا گروه EAE بدون درمان اختصاص یافتند و امتیازهای بالینی تا حدود روز 30 دنبال شدند.
از روز 15 تا روز 30، امتیازهای بالینی موش‌های تحت درمان به‌طور معناداری پایین‌تر از موش‌های شاهد مبتلا به EAE بود، با P کمتر از 0.01. بررسی نخاع نیز در همین جهت بود و ارتشاح التهابی کمتر، میلین‌زدایی کمتر و از دست رفتن آکسون کمتر را در حیوانات تحت درمان نشان داد.
بخش متمایز مطالعه، مجموعهٔ سنجش‌های پیام‌رسانی بود. درمان، فعال‌شدن AMPK و بیان SIRT1 را افزایش داد و فعال‌شدن NF-kB، یک کلید مرکزی التهاب، را سرکوب کرد. در بخش ایمنی اکتسابی، پاسخ Th17 را کاهش داد و پاسخ Treg را تقویت کرد. بنابراین زنجیرهٔ پیشنهادی چنین است: متیلن بلو، سپس AMPK و SIRT1، سپس کاهش پیام‌رسانی NF-kB، سپس تغییر از Th17 التهابی به‌سوی Treg تنظیمی، سپس آسیب بافتی خفیف‌تر و در نهایت امتیازهای پایین‌تر.
این زنجیره یک تفسیر است، نه یک توالی علّی اثبات‌شده. مطالعه نشان می‌دهد که دارو، تغییرات پیام‌رسانی و بهبود بیماری با هم همراه بوده‌اند. اما ثابت نمی‌کند که AMPK و SIRT1 مسئول تمام اثر سودمند هستند. همچنین متن نمایه‌شدهٔ در دسترس عموم، دوز دقیق بر حسب میلی‌گرم به ازای کیلوگرم، مسیر تجویز، روز شروع یا مدت درمان را آن‌قدر روشن بیان نمی‌کند که بتوان برنامهٔ تجویز را صرفاً از روی چکیده بازسازی کرد. هر عددی دربارهٔ دوز این مقاله که در یک صفحهٔ فروش نقل شده است را تأییدنشده بدانید، مگر اینکه به بخش روش‌های متن کامل استناد کند. مجموعهٔ گسترده‌تر شواهد انسانی دربارهٔ متیلن بلو جایی است که باید بررسی کرد آیا این نشانهٔ اولیهٔ ایمنی در نهایت به داده‌های بالینی رسیده است یا نه.
نتیجهٔ آسیب‌شناسی: بافت طی شش ماه چه نشان داد
مطالعهٔ MP4 سال 2015 در PLoS ONE از موش‌های مادهٔ C57BL/6 استفاده کرد که با 200 میکروگرم MP4 در ادجوانت کامل فروند ایمن‌سازی شدند و سم سیاه‌سرفه را در روز ایمن‌سازی و بار دیگر 48 ساعت بعد دریافت کردند. هیچ حیوانی متیلن بلو را به‌عنوان دارو دریافت نکرد. پس از تثبیت و قالب‌گیری بافت، برش‌های عرضی نخاع با ضخامت یک میکرومتر برای میکروسکوپی نوری با متیلن بلو رنگ‌آمیزی شدند؛ برای مشاهدهٔ جزئیات دقیق‌تر نیز از میکروسکوپی الکترونی راه عصبی شکمی‌جانبی استفاده شد.
نمونه‌برداری بافت در سه مرحله انجام شد: اوج حاد با 7 موش، سه ماه پس از شروع با 5 موش و شش ماه پس از شروع با 10 موش. میانگین امتیازهای بالینی در این مراحل تقریباً یکسان به نظر می‌رسید و در مقیاس 0 تا 5، نزدیک به 1.7 تا 1.8 بود. اما بافت داستان دیگری داشت. تعداد رشته‌هایی که فقط میلین آن‌ها آسیب دیده بود، از حدود 569,000 رشته در هر میلی‌متر مربع در اوج حاد به حدود 1,496,000 در شش ماه رسید؛ مقایسهٔ مرحلهٔ حاد با مرحلهٔ بلندمدت با P برابر با 0.027 معنادار بود. آسیب ترکیبی میلین و آکسون تا شش ماه تقریباً دو برابر شد. رشته‌های در حال میلین‌سازی مجدد در تمام مراحل کمتر از یک درصد باقی ماندند؛ جزئیاتی که خوش‌بینی دربارهٔ ترمیم را تعدیل می‌کند.
آسیب آکسونی الگویی U شکل داشت: در اوج حاد زیاد بود، در سه ماه کاهش یافت و در شش ماه به بیشترین مقدار رسید. این آسیب با تورم میتوکندری و کاهش فاصلهٔ میان نوروفیلامنت‌ها همبستگی داشت. ارزیابی بدون اطلاع از امتیاز و مرحله انجام شد؛ نکته‌ای که این برداشت را تقویت می‌کند که امتیازهای بالینی، آسیب ساختاری ادامه‌دار را کمتر از واقع نشان می‌دادند.
این ناهمخوانی، دستاورد اصلی مطالعه برای خوانندهٔ علاقه‌مند به MS است. ثابت‌ماندن امتیاز ناتوانی به معنای ثابت‌ماندن وضعیت بافت نبود. همچنین نشان می‌دهد چرا این مقاله نمی‌تواند از هیچ ادعایی دربارهٔ درمان MS با متیلن بلو پشتیبانی کند. موضوع آزمون، زمان بود، نه درمان.
چرا هیچ‌یک از این مطالعات سودمندی در بیماران را اثبات نمی‌کند
هر مقاله را پاسخی خوب به یک پرسش محدود در نظر بگیرید که هیچ پاسخی به پرسش مربوط به بیماران نمی‌دهد.
نخست، علت متفاوت است. EAE عمداً با یک آنتی‌ژن مشخص و ادجوانت القا می‌شود. MS انسانی به‌طور خودبه‌خود و با مجموعهٔ گسترده‌تری از اجزای ایمنی، شامل سلول‌های T، سلول‌های B، ایمنی ذاتی و سلول‌های گلیای مقیم، شکل می‌گیرد. ترکیبی که پاسخ متمایل به MOG را در موش تغییر می‌دهد، لزوماً آن پاسخ گسترده‌تر انسانی را تغییر نمی‌دهد.
دوم، فنوتیپ متفاوت است. ضعف صعودی از دم تا اندام‌های عقبی در موش، شاخصی آسان برای ارزیابی است. این شاخص ناهمگونی MS انسانی را در یک عدد حرکتی خلاصه می‌کند. داروها به‌طور معمول امتیازهای کوتاه‌مدت EAE را تغییر می‌دهند، بی‌آنکه سیر بیماری در انسان را تغییر دهند؛ به همین دلیل EAE ابزاری برای غربالگری و بررسی سازوکار است، نه یک درمانگاه کوچک‌شده.
سوم، میزان مواجهه و زمان‌بندی هنوز روشن نیست. تجویز پیوسته و زودهنگام در یک آزمایش 30 روزهٔ موش، همان مصرف خوراکی مزمن در فردی با بیماری تثبیت‌شده نیست؛ و هیچ‌یک از مطالعات سطح دارو را در دستگاه عصبی اندازه‌گیری نکرد. بدون این ارتباط، پلی از غلظت در یک پلیت آزمایشگاهی یا دوز در موش به یک برنامهٔ تجویز انسانی وجود ندارد.
چهارم، این دو مقاله تکرار یکدیگر نیستند. آنتی‌ژن‌های متفاوت، پرسش‌های متفاوت، شاخص‌های پیامد متفاوت و در یک مورد، اصلاً هیچ درمانی وجود ندارد. استناد به آن‌ها در کنار هم به‌عنوان دو مطالعهٔ مثبت دربارهٔ درمان MS، خطایی در دسته‌بندی است.
این موضوع برای خوانندگانی که شواهد را می‌سنجند چه معنایی دارد
در این مقاله‌ها هیچ پروتکل تثبیت‌شده‌ای برای استفاده از متیلن بلو در MS وجود ندارد. مطالعهٔ درمانی از پژوهش بیشتر دربارهٔ AMPK، SIRT1، NF-kB و تعادل Th17 و Treg در MOG EAE پشتیبانی می‌کند. مطالعهٔ آسیب‌شناسی یادآوری می‌کند که آسیب بافتی می‌تواند پیشرفت کند، در حالی که امتیازها ثابت به نظر می‌رسند؛ و متیلن بلو در بخش روش‌ها گاهی به ظرف رنگ‌آمیزی اشاره دارد، نه قفسهٔ دارو. خوانندگانی که پژوهش‌های در حال انجام دربارهٔ مولتیپل اسکلروزیس را دنبال می‌کنند، باید این تمایز میان رنگ و دارو را در نظر داشته باشند. پیش از آنکه کسی بر پایهٔ تیترهای آزمایشگاهی اقدامی کند، پرسش‌های ایمنی، از جمله خطرات خونی و تداخل‌ها، باید همراه با داده‌های عمومی ایمنی متیلن بلو در گفت‌وگو با پزشک بررسی شوند.
جمع‌بندی در یک جمله می‌گنجد: یکی از مطالعات مورد استناد، متیلن بلو را به موش‌های مبتلا به MOG EAE داد و بیماری خفیف‌تر همراه با تغییر ضدالتهابی در پاسخ ایمنی را گزارش کرد، در حالی که مطالعهٔ دیگر هیچ دارویی تجویز نکرد و متیلن بلو را فقط برای رنگ‌آمیزی نخاع به کار برد تا انباشت آسیب میلین و آکسون را طی شش ماه ثبت کند؛ بنابراین این دو مطالعه ثابت نمی‌کنند که متیلن بلو به MS انسانی کمک می‌کند.