آیا متیلن بلو می‌تواند کمپلکس III میتوکندری را دور بزند؟ چرا مطالعات اختلاف دارند

دو آزمایشگاه پرسیدند آیا متیلن بلو می‌تواند کمپلکس III مسدودشده میتوکندری را دور بزند. یکی پاسخ منفی داد. دیگری پاسخ مثبت داد. هر دو داده داشتند.

مطالعه نخست، روی میتوکندری‌های مغز موش، نشان داد که این رنگ نمی‌تواند چنین کاری انجام دهد. مطالعه دوم، روی میتوکندری‌های مغز سه گونه جونده، نشان داد که تا حدی می‌تواند. مطالعه سومی روی کبد موش اغلب در کنار این دو ذکر می‌شود، اما موضوع دیگری را آزمایش کرده بود. اگر آن را در جایگاه درست خودش قرار دهیم، نیمی از ابهام برطرف می‌شود.

نمی‌توان سازوکاری جهان‌شمول اعلام کرد. با سه آزمایش با مسدودکننده‌ها، دوزها و شاخص‌های اندازه‌گیری متفاوت روبه‌رو هستیم. ابتدا شرایط را بخوانید. نتیجه‌گیری‌ها از آن‌ها پیروی می‌کنند.

دور زدن در اینجا چه معنایی دارد

الکترون‌ها از طریق کمپلکس I، از NADH، یا کمپلکس II، از سوکسینات، وارد زنجیره می‌شوند، از کمپلکس III به سیتوکروم c می‌رسند و سپس از طریق کمپلکس IV به اکسیژن منتقل می‌شوند. گرادیانی که در این مسیر ایجاد می‌شود، همان چیزی است که سلول برای ساخت ATP مصرف می‌کند.

ادعای دور زدن به این معناست که متیلن بلو الکترون‌ها را پیش از محل انسداد دریافت می‌کند و پس از آن تحویل می‌دهد. رنگ اکسیدشده الکترون‌ها را از NADH یا اجزای ابتدایی زنجیره می‌گیرد و به لوکومتیلن بلو تبدیل می‌شود؛ سپس شکل احیاشده آن‌ها را به سیتوکروم c می‌دهد یا به زنجیره بازمی‌گرداند. اگر انتقال در پایین‌دست محل انسداد انجام شود، تنفس و پتانسیل غشا تا حدی بازیابی می‌شوند. اگر انتقال در محل انسداد یا بالادست آن انجام شود، هیچ‌کدام بازیابی نمی‌شوند.

یک ویژگی کمپلکس III بخش بزرگی از این اختلاف را تعیین می‌کند. این کمپلکس چرخه Q را با دو جایگاه مهارکننده اجرا می‌کند. آنتی‌مایسین به جایگاه Qi متصل می‌شود. میکسوتیازول به جایگاه Qo متصل می‌شود. مطالعه‌ای که فقط یکی از آن‌ها را به کار برده، تنها نیمی از کمپلکس را آزموده است.

مطالعه نخست: نبود دور زدن در میتوکندری‌های مغز موش

Gureev و همکاران از میتوکندری‌های قشر مغز موش‌های C57BL/6 استفاده کردند که با دیژیتونین جدا شده بودند و در غلظت پروتئین 0.1 mg per ml سنجیده شدند. سوبستراها سه وضعیت را پوشش می‌دادند: پیرووات همراه با مالات، هرکدام با غلظت 5 mM؛ سوکسینات با غلظت 10 mM همراه با گلوتامات با غلظت 2 mM؛ و L-پرولین با غلظت 10 mM. مسدودکننده‌ها روتنون با غلظت 1 micromolar برای کمپلکس I و آنتی‌مایسین با غلظت 1 microgram per ml برای کمپلکس III بودند. دوزهای رنگ 0.5، 1 و 2 micromolar بود و 1 micromolar غلظت اصلی محسوب می‌شد. روش‌ها و منحنی‌های ثبت‌شده در گزارش FEBS Letters آمده‌اند.

دور زدن کمپلکس I موفق بود. روتنون تنفس تحریک‌شده با ADP را از حدود 121 به حدود 2 nmol per minute per mg کاهش داد و رنگ با غلظت 1 micromolar آن را به حدود 21 بازگرداند. پتانسیل غشا در حضور پیرووات همراه با مالات و نیز در حضور L-پرولین بازیابی شد.

دور زدن کمپلکس III موفق نبود. آنتی‌مایسین تنفس را به حدود 16 کاهش داد و رنگ آن را فقط به حدود 20 رساند. پتانسیل غشا در حضور هیچ‌یک از سوبستراها، حتی با دوزهای رنگ تا 5 micromolar، بازیابی نشد. داده‌های پراکسید نیز همین جهت را نشان می‌دادند: رنگ به‌تنهایی آزادسازی پراکسید را از نرخ پایه نزدیک به 76 pmol per minute per mg به حدود 1170، 1460 و 1945 در سه دوز افزایش داد، اما آنتی‌مایسین این سیگنال ناشی از رنگ را به‌ترتیب حدود 25، 88 و 96 درصد کاهش داد. اگر رنگ احیاشده مستقیماً با اکسیژن واکنش می‌داد، مسدود کردن کمپلکس III نباید این سیگنال را سرکوب می‌کرد. نویسندگان استنباط کردند که رنگ احیاشده در جایگاه Qo کمپلکس III، در بالادست محل انسداد آنتی‌مایسین، اکسید می‌شود. حلقه کوتاه، به زبان ساده: دهنده‌ها به رنگ، رنگ به Qo، سپس ادامه مسیر عادی. روتنون دور زده می‌شود. آنتی‌مایسین نه.

مطالعه دوم: دور زدن جزئی در سه گونه، در هر دو جایگاه مهارکننده

Svab و همکاران طراحی آزمایش را گسترش دادند. میتوکندری‌های مغز موش، رت و خوکچه هندی با پرکول جدا شدند و در همان غلظت 0.1 mg per ml، با پیرووات همراه با مالات یا گلوتامات همراه با مالات، هرکدام با غلظت 5 mM، سنجیده شدند. آن‌ها از دو مسدودکننده کمپلکس III استفاده کردند: آنتی‌مایسین A با غلظت 0.3 micromolar و میکسوتیازول با غلظت 1 micromolar. غلظت رنگ در بیشتر سنجش‌ها 2 micromolar و در آزمایش‌های سیتوکروم c برابر با 0.5 بود. هر سه گونه با پروتکل‌های یکسان در مقاله با دسترسی آزاد بررسی شده‌اند.

هر دو انسداد در هر سه گونه تا حدی دور زده شدند. در میتوکندری‌های موش، آنتی‌مایسین تنفس را سرکوب کرد و رنگ آن را حدود 60 درصد افزایش داد، از تقریباً 37 به 59 nmol per minute per mg. میکسوتیازول آن را 88 درصد کاهش داد و به حدود 4.5 رساند؛ سپس رنگ آن را پنج برابر کرد و به حدود 23 رساند. در حضور هر یک از مهارکننده‌ها، پتانسیل غشا تا حدی بازقطبی شد. برای کنار گذاشتن آرتیفکت‌های نوری، این پتانسیل با دو رنگ، سافرانین O و TMRM نسبت‌سنجی، اندازه‌گیری شد.

این مقاله انتقال الکترون را مستقیماً نیز آزمود؛ کاری که مطالعه نخست هرگز انجام نداد. سیتوکروم c استیله‌شده برون‌زاد با غلظت 25 micromolar، در حضور یا نبود مهارکننده‌ها، به‌وسیله میتوکندری‌های دارای انرژی احیا نشد، اما افزودن رنگ در هر دو حالت موجب احیا شد. در بافر بدون سلول، NADH همراه با رنگ، سیتوکروم c را با نرخی متناسب با NADH احیا کرد. جهش بلندتر، به زبان ساده: معادل‌های احیاکننده به رنگ، رنگ مستقیماً به سیتوکروم c، و کمپلکس IV به اکسیژن. این مسیر کمپلکس III را کاملاً کنار می‌گذارد، بنابراین هر دو مسدودکننده را می‌توان دور زد.

دو شاخص اندازه‌گیری دیگر نیز از این برداشت پشتیبانی می‌کنند. با افزودن رنگ به میتوکندری‌های تیمارشده با میکسوتیازول، فلورسانس NAD(P)H کاهش یافت؛ یعنی معادل‌های احیاکننده از مسیر جدید مصرف شدند. همچنین جذب نوری رنگ در 660 nm تغییرات ناشی از هر افزودن را به‌ترتیب دنبال کرد، در حالی که مایع رویی پس از سانتریفیوژ نشان داد رنگ اکسیدشده درون میتوکندری‌های دارای انرژی بیش از صد برابر تجمع می‌یابد و سپس با فروپاشی پتانسیل از آن‌ها خارج می‌شود. تراز پروتون‌ها نیز با این برداشت سازگار است: کنار گذاشتن مراحل پمپاژ، به‌جای 10 پروتون، حدود 2 پروتون به‌ازای هر جفت الکترون باقی می‌گذارد. بنابراین مصرف سریع‌تر اکسیژن همراه با بازقطبی‌شدن فقط جزئی، همان چیزی است که از دور زدن واقعی انتظار می‌رود، نه شاهدی علیه آن.

همین آماده‌سازی پاسخ‌هایی ایجاد کرد که خواندن سطحی را گمراه‌کننده می‌کنند. در حضور مهارکننده همراه با رنگ، ADP به‌جای افزایش تنفس آن را کاهش داد و مسدود کردن انتقال به‌جای کند کردن تنفس آن را تحریک کرد، در حالی که پتانسیل غشا همچنان در جهت‌های معمول تغییر می‌کرد. مصرف اکسیژن به‌تنهایی در این سامانه گمراه‌کننده است.

مطالعه سوم: مطالعه کبد که کمپلکس‌های I و II را آزمود، نه III

Lee و Boelsterli از میتوکندری‌های کبد موش و هپاتوسیت‌های کشت‌شده استفاده کردند که با افاویرنز، با اثر بر کمپلکس I و IC50 نزدیک به 30 micromolar، و هیدرازین، متابولیت ایزونیازید، با اثر بر کمپلکس II و IC50 نزدیک به 30 micromolar، آسیب دیده بودند. رنگ با غلظت حدود 30 micromolar اکسیداسیون NADH، پتانسیل غشا و ATP را بازیابی کرد و هم‌زمان اکسیدان‌ها و مرگ نکروتیک را کاهش داد. مقاله Redox Biology این فرایند را به‌صورت حمل الکترون‌ها به‌وسیله رنگ از مسیری پیرامون کمپلکس‌های آسیب‌دیده I و II مدل‌سازی می‌کند.

این نتیجه، زمینه‌ای پذیرفته‌شده درباره بالادست زنجیره است و چیزی درباره کمپلکس III نمی‌گوید، زیرا در آن مطالعه هیچ انسدادی در این کمپلکس ایجاد نشده بود. این نتیجه نمی‌تواند هیچ‌یک از دو مطالعه مغز را تأیید یا رد کند.

ماتریس شرایط

چهار دلیل که هر دو مطالعه کمپلکس III می‌توانند درباره شرایط آزمایش خود درست باشند

1. مسدودکننده‌ها مداخله یکسانی نبودند. آنتی‌مایسین به‌تنهایی با غلظت 1 microgram per ml در برابر آنتی‌مایسین با غلظت 0.3 micromolar و یک مسدودکننده جداگانه جایگاه Qo. مسیر رنگی که الکترون‌ها را به جایگاه Qo می‌رساند، دقیقاً در جایی شکست می‌خورد که مسیر مستقیم به سیتوکروم c موفق می‌شود. یک جایگاه نمی‌تواند نماینده هر دو باشد.

2. دوز رنگ و زمان‌بندی متفاوت بود. غلظت‌های اصلی 1 در برابر 2 micromolar بودند، آن هم برای ماده‌ای با چرخه اکسایش‌کاهش که جذب آن و احیای مستقیم سیتوکروم c به‌وسیله آن به غلظت و زمان وابسته است. اختلاف‌های کوچک دوز همراه با زمان‌بندی متفاوت اندازه‌گیری می‌توانند بخش‌های متفاوتی از یک شبکه را آشکار کنند.

3. آماده‌سازی‌ها متفاوت بودند. جداسازی با دیژیتونین در برابر جداسازی با گرادیان پرکول، جمعیت‌هایی از میتوکندری را انتخاب می‌کند که هم‌پوشانی دارند، اما یکسان نیستند. غلظت پروتئین در هر دو برابر با 0.1 mg per ml بود، پس این متغیر کنار می‌رود؛ اما زیرجمعیت‌ها و یکپارچگی میتوکندری‌ها چنین نیستند. تفاوت گونه نیز از مظان اتهام خارج شد: گروه دوم همان الگوی پاسخ را در موش هم بازتولید کرد.

4. وضعیت سوبسترا تعیین می‌کند رنگ چه کاری می‌تواند انجام دهد. سه وضعیت سوبسترا در برابر جفت‌های وابسته به NADH قرار داشتند. تأمین NADH و پتانسیل غشا با هم تعیین می‌کنند رنگ با چه سرعتی احیا شود و چگونه میان بخش‌ها توزیع شود؛ مسیری هم که به رنگ احیاشده در کنار سیتوکروم c اکسیدشده نیاز دارد، به این انتخاب وابسته است.

ادعای بعدی درباره دور زدن را چگونه بخوانیم

بپرسید کدام کمپلکس، با کدام مهارکننده، در کدام جایگاه و با چه دوزی مسدود شده است. غلظت رنگ و زمان اندازه‌گیری را بپرسید. درباره بافت، گونه، روش جداسازی، غلظت پروتئین و سوبسترا بپرسید. همچنین بپرسید آیا پتانسیل، تنفس، وضعیت اکسایش‌کاهش و سنجش انتقال مستقیم با یکدیگر هم‌خوانی دارند، زیرا در اینجا مصرف اکسیژن به‌تنهایی بیش از یک بار به برداشت نادرست منجر شد.

جمع‌بندی محدود همچنان معتبر است. درباره دور زدن کمپلکس I با رنگ توافق وجود دارد. درباره کمپلکس III، میتوکندری‌های موش با آنتی‌مایسین در غلظت 1 microgram per ml و رنگ در غلظت 1 micromolar هیچ دور زدن عملکردی نشان نمی‌دهند؛ در مقابل، سه گونه با آنتی‌مایسین در غلظت 0.3 micromolar یا میکسوتیازول در غلظت 1 micromolar و رنگ در غلظت 2 micromolar، دور زدن جزئی همراه با انتقال مستقیم از رنگ به سیتوکروم c نشان می‌دهند. این دو گزاره می‌توانند هم‌زمان درست باشند. هر نتیجه‌گیری گسترده‌تر، برون‌یابی است.

مطالعه مطالب مرتبط، ادعای محل اختلاف را در چارچوب شیمی پذیرفته‌شده نگه می‌دارد: متیلن بلو چگونه الکترون‌ها را جابه‌جا می‌کند برای سازوکار انتقال مرحله‌ای، آزمایش‌های دور زدن کمپلکس I برای مورد پذیرفته‌شده بالادست، اندازه‌گیری‌های پتانسیل غشا و آرتیفکت‌های آن‌ها برای توضیح اینکه چرا دو رنگ لازم بود، و کار با مواد دارای چرخه اکسایش‌کاهش در آزمایشگاه برای شناخت دام‌های دوز و زمان‌بندی.