مقاله
جایگزینهای متیلن بلو برای میکروسکوپی: بر اساس کار موردنظر انتخاب کنید
برای یک اسمیر ساده باکتریایی، زمانی که هدف مشاهده شکل سلول است، کریستال ویولت میتواند جای متیلن بلو را بگیرد. برای سلولهای زنده، گزینه بهتر ممکن است کنتراست فازی بدون هیچگونه رنگآمیزی باشد. انتخاب به مشاهدهای بستگی دارد که باید انجام دهید.
فرض کنید دو نفر یک کشت باکتریایی یکسان را بررسی میکنند. یکی میخواهد باکتریهای میلهای را از سلولهای گرد تشخیص دهد. دیگری میخواهد بداند آیا یک تیمار باکتریها را کشته است یا نه. رنگی که برای نفر اول تصویری واضح ایجاد میکند، ممکن است برای نفر دوم هیچ پاسخ قابلاستفادهای فراهم نکند.
پیش از انتخاب جایگزین، این جمله را کامل کنید: «باید ___ را در ___ مشاهده کنم، و سلولها باید / لازم نیست زنده بمانند.» این جمله مشخص میکند رنگ باید چه کاری انجام دهد.
از نمونه و پرسش شروع کنید
ابتدا مشخص کنید آیا سلولها باید زنده بمانند، سپس ویژگی موردنظر برای مشاهده را تعیین کنید:
- سلولها باید زنده بمانند: برای حرکت یا شکل، کنتراست فازی بدون رنگآمیزی یا DIC را در نظر بگیرید؛ برای DNA هستهای، Hoechst 33342 همراه با فلورسانس را در نظر بگیرید؛ برای یکپارچگی غشا، یک آزمون اعتبارسنجیشده مانند SYTO 9 همراه با پروپیدیوم یدید را انتخاب کنید.
- لازم نیست سلولها زنده بمانند: برای مورفولوژی باکتریایی، رنگآمیزی ساده با کریستال ویولت یا رنگآمیزی منفی با نیگروزین را در نظر بگیرید؛ برای واکنش گرم، از روش کامل رنگآمیزی گرم استفاده کنید؛ برای DNA هستهای در سلولهای تثبیتشده، فلورسانس DAPI را در نظر بگیرید. از این جدول برای مقایسه محدودیتهای هر شاخه استفاده کنید. اینها انتخابهای روشی هستند، نه دستورالعملی برای جایگزین کردن بطریها در یک پروتکل موجود.
| آنچه باید مشاهده کنید | نمونه و تجهیزات | جایگزین پیشنهادی | محدودیت اصلی |
|---|---|---|---|
| شکل و آرایش باکتریها | اسمیر باکتریایی آمادهشده؛ میدان روشن | رنگآمیزی ساده با کریستال ویولت | مورفولوژی را نشان میدهد؛ واکنش گرم یا زندهمانی را مشخص نمیکند. |
| مرز سلولها در برابر پسزمینه تیره | آمادهسازی باکتریولوژیک؛ میدان روشن | رنگآمیزی منفی با نیگروزین | نحوه آمادهسازی و فرمولاسیون اهمیت دارد؛ رنگنگرفتن یک سلول لزوماً به معنای زنده بودن آن نیست. |
| واکنش گرم | اسمیر باکتریایی آمادهشده؛ میدان روشن | روش کامل رنگآمیزی گرم | به توالی کامل معرفها و کنترلها نیاز دارد. |
| حرکت یا تغییرات در سلولهای زنده | آمادهسازی مرطوب سازگار؛ کنتراست فازی یا DIC | بدون رنگ | به اپتیک مناسب نیاز دارد؛ کنتراست، یک مولکول را شناسایی نمیکند. |
| DNA هستهای | سلولهای تثبیتشده؛ فلورسانس | DAPI | به فیلترهای تحریک و نشر سازگار نیاز دارد. |
| DNA هستهای در سلولهای زنده | سلولهای زنده؛ فلورسانس | Hoechst 33342 | ورود به سلول نشان نمیدهد که شرایط تصویربرداری بیضرر است. |
| یکپارچگی غشای باکتریایی | باکتریهای تثبیتنشده؛ فلورسانس | SYTO 9 همراه با پروپیدیوم یدید | رنگآمیزی غشا یک سنجه غیرمستقیم از زندهمانی است. |
برای یک اسمیر ساده، روش را با دقت جایگزین کنید
کریستال ویولت زمانی یک گزینه عملی است که هدف، مشاهده تکرنگ مورفولوژی باکتریایی باشد. راهنمای Bacteriological Analytical Manual سازمان FDA، دو فرمولاسیون کریستال ویولت مناسب برای رنگآمیزی ساده را فهرست میکند. از یک فرمولاسیون مستند و روش آمادهسازی مربوط به آن استفاده کنید؛ نام رنگ بهتنهایی یک معرف آمادهبهکار را مشخص نمیکند.
کریستال ویولت در رنگآمیزی گرم نیز استفاده میشود، اما این موضوع یک رنگآمیزی ساده با کریستال ویولت را به رنگآمیزی گرم تبدیل نمیکند. در پروتکل رنگآمیزی گرم ASM، نتیجه افتراقی به عملکرد متوالی کریستال ویولت، ید، رنگبری و رنگآمیزی متقابل وابسته است. حذف این مراحل، آنچه تصویر میتواند نشان دهد را تغییر میدهد. برای این تفاوت، رنگآمیزی ساده در برابر رنگآمیزی گرم را ببینید.
نیگروزین روش متفاوتی برای آشکار کردن مرزها فراهم میکند: پسزمینه را تیره میکند، در حالی که سلولهای باکتریایی نسبتاً روشن باقی میمانند. در دستورالعمل نیگروزین Merck جزئیات مفیدی وجود دارد که ممکن است در یک فهرست عمومی از جایگزینها نادیده گرفته شود. فرمولاسیون کاری مشخصشده آن حاوی فرمالدهید است. بنابراین، حتی اگر خود سلولها ظاهراً رنگ نگرفته باشند، نمیتوان صرفاً از عبارت «رنگآمیزی منفی» سازگاری با سلول زنده را نتیجه گرفت. فرمولاسیون کامل و آمادهسازی نمونه را بررسی کنید.
برای نمونههای زنده، تغییر اپتیک را در نظر بگیرید
اگر میخواهید حرکت یا تقسیم سلولها را مشاهده کنید، افزودن یک رنگ دیگر ممکن است مشاهده را پیچیدهتر کند. همانطور که Nikon در راهنمای کنتراست در نمونههای شفاف توضیح میدهد، کنتراست فازی و کنتراست تداخل تفاضلی یا DIC، نمونهها را از طریق تفاوت در ویژگیهای اپتیکی آنها قابلمشاهده میکنند. این روشها میتوانند سلولهای زنده و رنگنشده را نشان دهند، مشروط بر اینکه میکروسکوپ اجزای لازم را داشته باشد.
این انتخاب یک آمادهسازی بدون رنگ را حفظ میکند، اما اطلاعات در دسترس را تغییر میدهد. میتوانید یک مرز یا حرکت را دنبال کنید، بدون اینکه بدانید کدام مولکول آن کنتراست را ایجاد کرده است. اگر پرسش درباره مکانیابی مولکولی است، بهجای آن یک روش نشاندارسازی مناسب انتخاب کنید.
برای DNA هستهای، مقایسه رنگهای DAPI و Hoechst توسط Invitrogen میان استفاده رایج DAPI برای سلولهای تثبیتشده و Hoechst 33342 با نفوذپذیری سلولی بیشتر، که برای نشاندارسازی سلول زنده ترجیح داده میشود، تمایز قائل میشود. هر دو به تجهیزات فلورسانس نیاز دارند. هیچیک جایگزین مستقیم یک رنگ رنگی برای میدان روشن نیستند.
مواجهه با رنگ و نوردهی را بهعنوان شرایط آزمایش در نظر بگیرید. زمانی که رفتار سلولها متغیر اندازهگیری شماست، آمادهسازیهای رنگشده و رنگنشده را با یکدیگر مقایسه کنید.
یک سلول قرمز الزاماً سلول مرده نیست
SYTO 9 و پروپیدیوم یدید اغلب بهصورت جفت برای ارزیابی یکپارچگی غشای باکتریایی استفاده میشوند. راهنمای BacLight غشاهای سالم را با رنگآمیزی سبز و غشاهای آسیبدیده را با رنگآمیزی قرمز مرتبط میداند. این تفسیر برای نمونه موردنظر به اعتبارسنجی نیاز دارد.
یک مطالعه 2019 توسط Rosenberg و همکاران این مشکل را نشان میدهد. در بیوفیلمهای 24-hour E. coli روی شیشه در محلول سالین بافر فسفات، حدود 96% از سلولها در محل، پروپیدیوم یدید مثبت به نظر میرسیدند. با این حال، نویسندگان برآورد کردند که پس از برداشت، 82% قابل کشت بودند. تصاویر کانفوکال سلولهایی با بخش داخلی سبز در زیر مواد رنگشده به رنگ قرمز نشان دادند که نشان میداد اسیدهای نوکلئیک خارجسلولی در ایجاد سیگنال گمراهکننده نقش داشتهاند.
این درصدها اندازهگیریهای متفاوت روی آمادهسازیهای همان مطالعه را توصیف میکنند، نه یک ضریب اصلاح عمومی. نکته کاربردی این است که بررسی کنید چه چیزی سیگنال را ایجاد کرده است. در یک بیوفیلم، رنگ اسید نوکلئیک میتواند مواد خارج از سلولها را نیز، علاوه بر مواد داخل سلولهای آسیبدیده، شناسایی کند. برای نتیجهگیری درباره زندهمانی، پژوهشگران اندازهگیریهای مکمل مانند کشت یا فعالیت متابولیک را توصیه میکنند، در حالی که محدودیتهای هرکدام را نیز میپذیرند.
بررسی کنید جایگزین واقعاً چه موادی دارد
یک روش رنگآمیزی جایگزین ممکن است همچنان حاوی متیلن بلو باشد. گیمسا یک نمونه است: Merck محصول خود را یک محلول azure-eosin-methylene-blue توصیف میکند که برای کاربردهایی از جمله اسمیرهای خون و مغز استخوان در نظر گرفته شده است. این میتواند روشی متفاوت برای نمونهای متفاوت باشد، اما الزام حذف متیلن بلو را برآورده نمیکند.
اگر حذف یک ترکیب بخشی از آزمایش است، پیش از مقایسه تصاویر، هویت معرف و فرمولاسیون را بررسی کنید. راهنمای متیل بلو، متیلن بلو و رنگهایی با نامهای مشابه تفاوتهای نامگذاری را توضیح میدهد.
پیش از استفاده از نتیجه، جایگزینی را بررسی کنید
برای یک روش جدید، با استفاده از نمونههای نماینده و یک کنترل مناسب، مقایسهای در مقیاس کوچک انجام دهید. در صورت امکان، تنظیمات میکروسکوپ را قابلمقایسه نگه دارید. فرمولاسیون معرف، آمادهسازی نمونه، مواجهه و شرایط تصویربرداری را ثبت کنید تا بتوان بررسی کرد چرا یک تصویر بهتر به نظر میرسد، نه اینکه صرفاً آن را ترجیح داد.
موفقیت را بر اساس پرسش اولیه ارزیابی کنید. برای مورفولوژی، بررسی کنید آیا مرزها و آرایش سلول همچنان قابل تفسیر هستند. برای نشاندارسازی هستهای، محل سیگنال و پسزمینه را ارزیابی کنید. برای زندهمانی، به شواهدی فراتر از یک تفکیک رنگی جذاب نیاز است. راهنمای گستردهتر درباره رنگآمیزی با متیلن بلو و کاربردهای آزمایشگاهی توضیح میدهد که مشاهده و آمادهسازی چگونه در کنار هم قرار میگیرند.
جایگزینی را انتخاب کنید که اندازهگیری موردنیاز شما را حفظ کند. رنگ فقط یکی از ویژگیهای تصویر حاصل است.