Mikroskopiarako metileno urdinaren alternatibak

Bakterio-frotis sinple baterako, kristal bioletak metileno urdina ordezka dezake helburua zelulen forma ikustea denean. Zelula bizietarako, alternatiba hobea tindaketarik gabeko fase-kontrastea izan daiteke. Aukera egin behar duzun behaketaren araberakoa da.

Demagun bi pertsona bakterio-kultura bera aztertzen ari direla. Batek makilatxo-formako zelulak zelula biribiletatik bereizi nahi ditu. Besteak jakin nahi du tratamendu batek bakterioak hil dituen. Lehenengo pertsonari irudi argia ematen dion tindagai batek baliteke bigarrenari erantzun erabilgarririk ez ematea.

Ordezko bat aukeratu aurretik, osatu esaldi hau: “___ behatu behar dut ___-n, eta zelulek bizirik jarraitu behar dute / ez dute bizirik jarraitu behar.” Esaldi horrek definitzen du tindagaiak bete behar duen zeregina.

Hasi laginetik eta galderatik

Lehenik erabaki zelulek bizirik jarraitu behar duten ala ez, eta ondoren identifikatu behatu behar duzun ezaugarria:

Zelulek bizirik jarraitu behar dute: mugimendua edo forma behatzeko, kontuan hartu tindatu gabeko fase-kontrastea edo DIC; DNA nuklearra behatzeko, kontuan hartu Hoechst 33342 fluoreszentziarekin; mintzaren osotasuna behatzeko, aukeratu baliozkotutako saiakuntza bat, hala nola SYTO 9 propidio ioduroarekin.
Zelulek ez dute bizirik jarraitu behar: bakterioen morfologia behatzeko, kontuan hartu kristal bioletazko tindaketa sinplea edo nigrosinazko tindaketa negatiboa; Gram erreakzioa behatzeko, erabili Gram tindaketaren metodo osoa; zelula finkoetako DNA nuklearra behatzeko, kontuan hartu DAPI fluoreszentzia.

Erabili taula hau adar bakoitzaren mugak alderatzeko. Hauek metodo-aukerak dira, ez lehendik dagoen protokolo batean botilak elkartrukatzeko jarraibideak.

Behatu behar duzuna	Lagina eta ekipamendua	Alternatiba hautagaia	Muga nagusia
Bakterioen forma eta antolamendua	Prestatutako bakterio-frotisa; eremu argia	Kristal bioletazko tindaketa sinplea	Morfologia erakusten du; ez du Gram erreakzioa edo bideragarritasuna ezartzen.
Zelulen ingeradak hondo ilun baten gainean	Prestakin bakteriologikoa; eremu argia	Nigrosinazko tindaketa negatiboa	Prestaketak eta formulazioak garrantzia dute; tindatu gabeko zelula bat ez dago nahitaez bizirik.
Gram erreakzioa	Prestatutako bakterio-frotisa; eremu argia	Gram tindaketaren metodo osoa	Erreaktiboen sekuentzia osoa eta kontrolak behar ditu.
Zelula bizien mugimendua edo aldaketak	Prestakin heze bateragarria; fase-kontrastea edo DIC	Tindagairik ez	Optika egokia behar du; kontrasteak ez du molekula bat identifikatzen.
DNA nuklearra	Zelula finkoak; fluoreszentzia	DAPI	Kitzikapen- eta emisio-iragazki bateragarriak behar ditu.
DNA nuklearra zelula bizietan	Zelula biziak; fluoreszentzia	Hoechst 33342	Zelulan sartzeak ez du frogatzen irudigintza-baldintzak kaltegabeak direnik.
Bakterioen mintzaren osotasuna	Finkatu gabeko bakterioak; fluoreszentzia	SYTO 9 propidio ioduroarekin	Mintzaren tindaketa bideragarritasunaren zeharkako neurketa da.

Frotis sinple baterako, ordezkatu metodoa kontu handiz

Kristal bioleta hautagai praktikoa da zeregina bakterioen morfologiaren kolore bakarreko ikuspegia lortzea denean. FDAren Bacteriological Analytical Manual-ek tindaketa sinplerako egokiak diren kristal bioletaren bi formulazio zerrendatzen ditu. Erabili dokumentatutako formulazio bat eta haren prestaketa-metodoa; tindagaiaren izenak bakarrik ez du lanerako erreaktibo bat zehazten.

Kristal bioleta Gram tindaketan ere erabiltzen da, baina horrek ez du kristal bioletazko tindaketa sinple bat Gram tindaketa bihurtzen. ASMren Gram tindaketaren protokoloan, emaitza diferentziala kristal bioletak, iodoak, dekolorazioak eta kontratindaketak sekuentzian jardutearen araberakoa da. Urrats horiek kentzeak aldatu egiten du irudiak zer ezar dezakeen. Ikusi tindaketa sinplearen eta Gram tindaketaren arteko aldea bereizketa hori ulertzeko.

Nigrosinak ingeradak agerian uzteko beste modu bat eskaintzen du: hondoa iluntzen du, bakterio-zelulek, berriz, nahiko argi jarraitzen dute. Mercken nigrosinaren jarraibideetan ordezkoen zerrenda generiko batek gal dezakeen xehetasun erabilgarri bat dago. Zehaztutako lan-formulazioak formaldehidoa dauka. Beraz, ezin duzu zelula biziekin bateragarria denik ondorioztatu “tindaketa negatiboa” hitzetatik soilik, nahiz eta zelulek berek tindatu gabe diruditen. Egiaztatu formulazio osoa eta laginaren prestaketa.

Lagin bizietarako, kontuan hartu optika aldatzea

Zelulak mugitzen edo zatitzen ikusi nahi badituzu, beste tindagai bat sartzeak behaketa zaildu dezake. Nikonek lagin gardenetako kontrasteari buruzko gidan azaltzen duen bezala, fase-kontrasteak eta interferentzia diferentzialeko kontrasteak, edo DICek, laginak ikusgai egiten dituzte haien propietate optikoen arteko desberdintasunen bidez. Zelula bizi eta tindatu gabeak agerian utz ditzakete, mikroskopioak beharrezko osagaiak baditu.

Aukera horrek tindatu gabeko prestakina mantentzen du, baina eskuragarri dagoen informazioa aldatzen du. Muga edo mugimendu bati jarrai diezaiokezu kontrastea zein molekulak sortu duen jakin gabe. Galdera kokapen molekularrari buruzkoa bada, aukeratu etiketatze-metodo egoki bat.

DNA nuklearrerako, Invitrogenen DAPI eta Hoechst tindagaien konparazioak bereizten ditu DAPIren ohiko erabilera zelula finkoekin eta zelula-iragazkortasun handiagoko Hoechst 33342, zelula biziak etiketatzeko hobetsi ohi dena. Biek fluoreszentzia-ekipamendua behar dute. Bata ere ez da eremu argiko tindagai koloredun baten ordezko zuzena.

Hartu tindagaiarekiko esposizioa eta argiztapena baldintza esperimental gisa. Zelulen portaera bada neurtzen ari zarena, alderatu tindatutako eta tindatu gabeko prestakinak.

Zelula gorri bat ez da automatikoki zelula hila

SYTO 9 eta propidio ioduroa maiz erabiltzen dira batera bakterioen mintzaren osotasuna ebaluatzeko. BacLight eskuliburuak mintz osoak tindaketa berdearekin eta kaltetutako mintzak tindaketa gorriarekin lotzen ditu. Interpretazio hori laginarentzat baliozkotu behar da.

Rosenberg eta lankideen 2019ko ikerketa batek arazoa erakusten du. Fosfatoz indargetutako gatz-disoluzioan beiraren gainean 24 orduz hazitako E. coli biofilmetan, zelulen %96 inguru propidio-ioduro-positibo agertu ziren in situ. Hala ere, egileek kalkulatu zuten bildu ondoren %82 hazkuntzan erreproduzigarriak zirela. Irudi konfokalek barrualde berdea zuten zelulak erakutsi zituzten gorriz tindatutako materialaren azpian, eta horrek azido nukleiko estrazelularrak seinale engainagarriarekin lotzen zituen.

Ehuneko horiek ikerketako prestakinetan egindako neurketa desberdinak deskribatzen dituzte, ez zuzenketa-faktore unibertsal bat. Ikasgai erabilgarria seinalea zerk sortu duen egiaztatzea da. Biofilm batean, azido nukleikoen tindagai batek zelulen kanpoko materiala detekta dezake, baita kaltetutako zelulen barruko materiala ere. Bideragarritasunari buruzko ondorio baterako, ikertzaileek neurketa osagarriak gomendatzen dituzte, hala nola kultibazioa edo jarduera metabolikoa, eta aldi berean aitortzen dute bakoitzak bere mugak dituela.

Egiaztatu alternatibak benetan zer daukan

Tindaketa-metodo alternatibo batek oraindik metileno urdina eduki dezake. Giemsa da adibide bat: Merckek bere produktua azure-eosin-methylene-blue disoluzio gisa deskribatzen du, besteak beste odol- eta hezur-muinaren frotisetarako pentsatua. Beste lagin baterako beste metodo bat izan daiteke, baina ez du metileno urdina baztertzeko baldintza betetzen.

Konposatu bat baztertzea esperimentuaren parte bada, egiaztatu erreaktiboaren identitatea eta formulazioa irudiak alderatu aurretik. Methyl blue, methylene blue eta antzeko izena duten tindagaiei buruzko gidak izendapen-desberdintasunak azaltzen ditu.

Egiaztatu ordezkapena emaitza erabili aurretik

Metodo berri baterako, egin konparazio txiki bat lagin adierazgarriak eta kontrol egoki bat erabiliz. Mantendu mikroskopioaren ezarpenak alderagarri ahal den neurrian. Erregistratu erreaktiboaren formulazioa, laginaren prestaketa, esposizioa eta irudigintza-baldintzak, itxura hobea duen irudi bat ikertu ahal izateko, besterik gabe hobetsi beharrean.

Ebaluatu arrakasta jatorrizko galderaren arabera. Morfologiarako, ebaluatu zelula-mugak eta antolamendua interpretatzeko moduan jarraitzen duten. Etiketatze nuklearrerako, ebaluatu seinalearen kokapena eta hondoa. Bideragarritasunerako, eskatu koloreen bereizketa erakargarritik haragoko ebidentzia. Metileno urdinaren tindaketari eta laborategiko aplikazioei buruzko gida zabalagoak behaketa eta prestaketa nola lotzen diren azaltzen du.

Aukeratu behar duzun neurketa gordetzen duen alternatiba. Kolorea sortzen den irudiaren propietateetako bat baino ez da.