Artikulua
Metileno urdina eta seneszentzia zelularra: zer neurtzen duten fibroblastoekin egindako esperimentuek
Ohiko interpretazio oker bat honela gertatzen da. Artikulu batek jakinarazten du metileno urdinak populazioaren 20 bikoizketa baino gehiago gehitu dizkiela kultibatutako fibroblastoei; irakurle batek, beraz, ondorioztatzen du zelula seneszenteak ezabatzen dituela edo gizakien bizi-iraupena antzeko neurrian luzatzen duela. Ondorioak berezkoa dirudi. Baina bi puntu desberdinetan da okerra.
Azpiko arazoa kontzeptuala da, ez zenbakizkoa. Populazioaren bikoizketek, seneszentzia-markatzaileek eta telomeroen neurketek galdera desberdin bana erantzuten dute. Metileno urdinari buruzko fibroblasto-ikerketak hobekien ulertzen dira kultibo-plaka batean dagoen zelula mota bakar baten seneszentziarako sarrera atzeratuari buruzko ikerketa gisa, neurketa mitokondrialek babestuta. Hori ez da jada seneszenteak diren zelulak selektiboki ezabatzea, ezta organismoaren zahartzea ere. Bereizketa horren testuinguru zabalagoa elektroien garraio mitokondrialak zelulen energia nola baldintzatzen duen ulertzearen eta metileno urdinari buruzko ikerketen baieztapenak interpretatzearen parte da.
Populazioaren bikoizketek historia zenbatzen dute, ez gaztetasuna
Emaitza nagusi gehienak IMR90 zeluletatik datoz: giza fetuaren birikako fibroblasto normalen andui bat, erreplikazio-ahalmen mugatua duena. Metileno urdinari eta IMR90 fibroblastoen erreplikazio-bizi-iraupenari buruzko lehen ikerketan, kultiboak egutegi baten arabera pasatu ziren, eta populazioaren bikoizketa metatuak erregistratu ziren kultiboak zatitzeari utzi zion arte. Maila nanomolarretan egindako tratamenduak, 100 nM ardatz hartuta, geldialdia iritsi aurretik 20 bikoizketa gehigarri baino gehiago metatzea ahalbidetu zien kultiboei.
Populazioaren bikoizketa kontabilitate-unitate bat da. Populazioa gutxi gorabehera zenbat aldiz bikoiztu den erregistratzen du. Ez du zuzenean adierazten banakako zelula bat seneszentea, kieszentea, diferentziatua edo hila den. Kultibo batek bikoizketak irabaz ditzake zelulek luzaroago mantentzen dutelako zatitzeko gaitasuna, estrespean zelula gutxiagok goiz gelditzen dutelako zatiketa, edo baldintzek azpipopulazio proliferatibo bat hautatzen dutelako. Zenbaketak bakarrik ezin ditu bide horiek bereizi.
Horregatik uztartzen dira bikoizketen zenbaketak markatzaileekin. Zenbaketak proliferazioak zenbat iraun zuen adierazten du. Markatzaileek, berriz, gelditutako edo bizirik iraun duten zelulak zer egoeratara igaro diren adierazten dute.
Ebaluazio-parametroen gida: zer adierazten duen markatzaile bakoitzak
Kultiboko seneszentzia hainbat neurketa independentek osatutako fenotipoa da. Tindaketa edo proteina bakar batek ez du frogatzen.
Hazkundearen geldialdia, DNA-sintesiaren galerarekin. Geldialdi iraunkorra egiaztatzeko, BrdU edo EdU txertatzearen murrizketa, morfologia laua eta berriz erein ondoren berriro ez haztea aztertzen dira. Horrek seneszentzia-geldialdia aldi baterako kieszentziatik bereizten du.
Seneszentziari lotutako beta-galaktosidasa. SA-beta-gal tindaketak jarduera lisosomala erakusten du pH 6.0 inguruan. Fibroblasto seneszenteek sarritan emaitza positiboa ematen dute masa lisosomala handitzen den heinean. Ez da espezifikoa; beraz, proliferazioarekin eta markatzaile molekularrekin batera interpretatzen da.
p16 eta p21 bideak. p16 proteinak CDK4 eta CDK6 bidez eta RB bidearen bidez jarduten du. p21 sarritan p53 bidez induzitzen da. Maila gorakorrek geldialdiaren ebidentzia indartzen dute, baina proteina bat ere ez da seneszentziarena bakarrik.
Jariatze-egoera. Seneszentziari lotutako jariatze-fenotipoak, edo SASP delakoak, zitokinen, kimiokinen, hazkunde-faktoreen eta proteasen askapen aldatuari egiten dio erreferentzia. SASP faktoreetarako RNA edo proteina analisiek zelulek inguruko zelulei nola bidaltzen dizkieten seinaleak deskribatzen dute. Ez dute erreplikazio-ahalmena zuzenean neurtzen.
Oxidatzaileak eta neurketa mitokondrialak. Metileno urdinari buruzko artikuluek geruza mitokondrial bat gehitzen dute: IV konplexuaren kantitatea eta jarduera, oxigeno-kontsumoa, hemo-sintesia, mintz-masa, mintz-potentziala, ATP eta oxidatzaileen seinaleak. Horiek atzeratutako geldialdiarekin batera agertzen den egoera metabolikoa deskribatzen dute. Ez dute berez seneszentzia definitzen, baina proposatutako mekanismoa probatzen dute. Ziklo erredoxaren eredua —NAD(P)H-k metileno urdina erreduzitzen du eta c zitokromoak berriz oxidatzen du— ziklo erredoxa oxidatzaileen ekoizpen txikiagoarekin lotzen duen IMR90 ikerketa horretan azaltzen da. Lotutako dosifikazioaren eta banaketaren logika metileno urdinaren farmakologian eta ehunen esposizioan lantzen da.
Telomeroen higadura-tasa. Unitate egokia asteetan zehar bikoizketa bakoitzeko galdutako base-pareak dira, ez une bakarreko luzera. Higadura motelagoak erreplikazio bakoitzeko laburtze txikiagoa esan nahi du. Ez du luzatzea esan nahi, eta estresak IMR90 zelulen zatiketa geldiaraz dezake telomeroetan aldaketa gutxi eraginda.
Fibroblastoen hiru diseinu alderatuta
Orrialde honetako jatorrizko baliabidea beheko alderaketa da. Zelula mota, esposizioa, neurketa eta muga ikuspegi bakarrean biltzen ditu.
| Ikerketa | Zelulak eta esposizioa | Zer neurtu zen | Zer ezin duen erakutsi |
|---|---|---|---|
| Atamna et al., FASEB J 2008 | IMR90 fibroblasto normalak, metileno urdin nanomolar kronikoa, 100 nM baldintza estandar gisa | Bikoizketa metatuak, IV konplexuaren edukia, oxigeno-kontsumoaren ehuneko 37 eta 70 arteko igoera, hemo-sintesia, hidrogeno peroxidoak edo kadmioak eragindako seneszentzia goiztiarretik berreskuratzea, 2. faseko entzimak HepG2 zeluletan | Ez da zelula seneszenteen ezabaketa probatzen. Ez dago animalien edo gizakien bizi-luzeraren ebaluazio-parametrorik. Erreplikazio-bizi-iraupenak hemen kultibo-plaka bateko bikoizketak esan nahi ditu. |
| Atamna et al., Redox Biology 2015, AMPKri eta IV konplexuaren biogenesiari buruzko jarraipen-ikerketa mekanistikoan deskribatua | IMR90 fibroblastoak, nagusiki 100 nM metileno urdinarekin, eta AICAR AMPKren aktibatzaile kroniko gisa alderatzeko | NAD/NADH erlazioaren denborako bilakaera, AMPKren fosforilazio iragankorra, PGC-1alpha eta SURF1 indukzioa, IV konplexuaren jardueraren ehuneko 100 baino gehiagoko igoera, oxidatzaileen ehuneko 28ko murrizketa, telomeroen higadura motelagoa, 18 bikoizketa gehigarri inguru AICARrekin lortutako 2 ingururen aldean, zelula-zikloan eraginik ez | AICARrekiko alderaketan, dosia gutxi gorabehera 1000 aldiz desberdina da, eta espezifikotasuna ere desberdina da; beraz, aktibazio-eredua probatzen du, ez parekatutako potentzia. Telomeroen emaitza asteetan zehar zatitzen ari diren kultiboei dagokie. |
| Xiong et al., Aging Cell 2016, progeriako fibroblastoen berreskuratze mitokondrial eta nuklearrari buruzko ikerketan jasoa | Hutchinson-Gilford progeriako larruazaleko fibroblasto primarioak eta parekatutako kontrol normalak, gehienetan 100 nM, 5 eta 12 aste bitartean | Mitokondrien forma fluoreszentzia- eta mikroskopia elektronikoaren bidez, mugikortasuna zuzeneko irudien bidez, superoxidoa, mintz-potentziala, ATP, PGC-1alpha, proliferazio- eta seneszentzia-markatzaileak, baita nukleoko mintzaren irtenguneak, progerinaren kokapena, heterokromatina eta gene-adierazpena ere | Gaixotasun jakin bati lotutako zahartze goiztiarraren eredua, ez zahartze normala. Morfologia eta markatzaileak berreskuratzea ez da zelula seneszenteak ezabatzea. Ez dago animalien eraginkortasunaren ebaluaziorik edo ebaluazio-parametro klinikorik. |
| Xue et al., Cells 2021 berrikuspena, metileno urdina zahartzearen aurkako konposatu hautagai gisa aztertzen duen berrikuspenean laburbildua | Garunaren zahartzeari, neuroendekapenari, larruazalari, zaurien sendatzeari eta progeriari buruzko literaturaren sintesia | Metileno urdina ziklo erredox katalitikoetan aritzen den konposatu gisa aurkezten du, I eta III konplexuetako fluxuaren zati batzuk saihes ditzakeena, zahartzearen erradikal askeen teoriekin alderatuta | Sintesi narratiboa baino ez da. Hipotesiak antolatzen ditu eta ebidentzia klinikoa non den oraindik ez-erabakigarria adierazten du. |
Lerro guztietan agertzen den eredua edozein lerro bakar baino garrantzitsuagoa da. Dosi txikiko metileno urdina behin eta berriz lotzen da proliferazio-aldi luzeagoarekin, IV konplexuaren jarduera handiagoarekin, oxidatzaileen seinale txikiagoekin eta morfologia hobetuarekin. Diseinua luzetarakoa da beti: zatitzen ari diren zelulekin hasi, hedapenean tratatu eta zatiketak zenbat denboraz jarraitzen duen erregistratu. Egitura horrek atzerapenari buruzko baieztapen bat babes dezake. Ezin du ezabaketari buruzko baieztapenik babestu beste diseinu bat gabe.
Seneszentzia atzeratzea ez da zelula seneszenteak ezabatzea
Atzerapenak esan nahi du zatitzen ari diren zelulek luzaroago jarraitzen dutela zatitzen, gelditu aurretik. Ezabaketak, sarritan efektu senolitikoa deituak, esan nahi du jada seneszenteak diren zelulak selektiboki hiltzen edo gutxitzen direla, inguruko zelula proliferatiboek bizirik jarraitzen duten bitartean.
Metileno urdinari buruzko fibroblasto-literaturak lehen egitura probatzen du. Kultiboak proliferazio-egoeran hasten dira, tratamendua jasotzen dute pasatze serialean, eta geroago iristen dira geldialdira. SA-beta-gal, p16, p21 eta SASP faktoreak bezalako markatzaileak, beraz, geroago agertzen dira, edo maila txikiagoetan pasatze jakin batean. Eredu hori espero izatekoa da hasiera atzeratzen den bakoitzean. Ez du frogatzen jada ezarritako zelula seneszenterik ezabatu denik.
Baieztapen senolitiko batek beste antolaketa bat beharko luke: lehenik kultibo bat egiaztatutako seneszentziara eraman, gero konposatua aplikatu, eta ondoren zelula seneszente horien galera selektiboa erakutsi kontrol proliferatiboekin alderatuta, bideragarritasunaren eta heriotzaren neurketa zuzenekin. Markatzaile bat jaistea bakarrik ez da nahikoa, adierazpena zelularik galdu gabe alda daitekeelako, eta geratzen diren zelula proliferatiboek kultibo-plaka har dezaketelako. Aipatutako lau iturrietako batek ere ez du metileno urdinarentzat gutxitze selektiboko diseinu hori erabiltzen; beraz, izendapen zehatza in vitro seneszentzia atzeratzen duen edo seneszentziaren aurkako jarduera da oraindik, ez jarduera senolitikoa. Bereizketa horren estres oxidatiboari dagokion alderdia xeheago azaltzen da zelulek oxigeno-espezie erreaktiboak nola kontrolatzen dituzten azaltzen duen artikuluan.
Seinaleztapen iragankorraren emaitzak bereizketa are argiago egiten du. 2015eko IMR90 lanean, metileno urdinak NAD/NADH erlazioaren igoera labur bat eta AMPKren fosforilazio labur bat eragin zituen; ondoren, PGC-1alpha eta SURF1 induzitu ziren, biak IV konplexuaren biogenesiarekin lotuak. AICAR bidezko AMPKren aktibazio kronikoak emaitza askoz okerragoak eman zituen bikoizketa gehigarrietan.
Erreplikazio-bizi-iraupena ez da gizakien bizi-luzera
Zelulen erreplikazio-bizi-iraupenak geldialdiaren aurreko bikoizketak zenbatzen ditu, oxigenoa, kultibo-ingurunea eta pasatze-erritmoa finkatuta dituen kultibo-plaka kontrolatu batean. Gizakien bizi-luzerak hamarkadetako garapena, immunitatea, sistema baskularra, zelula amen nitxoak, portaera eta gaixotasunak biltzen ditu. Konposatu batek lehenengoa luza dezake bigarrena aldatu gabe, eta gehienek hala egiten dute.
Progeriako fibroblastoek progerina sortzen duen LMNA mutazio jakin bat dute, eta mitokondria zatikatu eta mugikortasun txikiagokoak, ATP baxua, itxura anormaleko nukleoak eta heterokromatinaren galera agertzen dituzte. Metileno urdin nanomolarrak neurri mitokondrialak hobetu zituen eta neurri nuklearrak nabarmen berreskuratu zituen, besteak beste progerina mintzetik askatuz. Zelula-mailako berreskuratze deigarria da. Hala ere, fibroblastoen emaitza izaten jarraitzen du, eta egileek animaliekin egindako probak etorkizuneko lan gisa planteatu zituzten. Gaixotasun-eredua bera xeheago lantzen da metileno urdinari, progeriari eta zahartze goiztiarraren ereduei buruzko artikuluan.
Hortik irakurketa praktikorako egiaztapen-zerrenda hau ondorioztatzen da.
- Galdetu tratamendua geldialdia baino lehen hasi zen edo geldialdia ezarri ondoren. Aurretik hastea atzerapenaren aldeko ebidentzia da. Ezabaketa frogatzeko, ondoren hastea eta heriotza selektiboari buruzko datuak behar dira.
- Galdetu nola bilakatu zen kontrolaren bikoizketa-kurba. Bikoizketa metaturik gabe, markatzaileen aldaketek ez dute erreferentziarik.
- Eskatu gutxienez bi markatzaile mota, hala nola proliferazio-etiketa bat gehi p16 edo p21 gehi SA-beta-gal, tindaketa bakarra erabili beharrean.
- Galdetu telomeroak nola aurkeztu ziren. Denboran zehar bikoizketa bakoitzeko tasak esanahia du. Une bakarreko luzera-neurketa batek ez.
- Galdetu zer mantendu zen konstante. Pasatze-dentsitateak, oxigenoak, kultibo-ingurunearen aldaketek eta metileno urdinaren stock-disoluzio freskoek edo zahartuek fibroblastoen geldialdia aldatzen dute.
Horrela irakurrita, fibroblastoen literaturak zeregin koherente baina mugatua ematen dio metileno urdinari: dosi txikiko konposatu erredox-aktibo bat, kultibatutako giza fibroblastoetan erreplikazio-seneszentzia atzeratzen duena, neurketa mitokondrialak hobetzen dituen bitartean. Xehetasun mekanistiko sendoenak energia-seinaleztapen iragankorraren eta IV konplexuaren biogenesiaren ingurukoak dira, eta artikulu horietan ez dago zelula seneszenteen ezabaketaren edo gizakien bizi-iraupenaren luzapenaren frogapenik.