Metileno urdinak mitokondrioetako III. konplexua saihestu al dezake? Zergatik ez datozen bat ikerketak

Bi laborategik aztertu zuten ea metileno urdinak blokeatutako mitokondrioetako III. konplexua saihestu dezakeen. Batek ezetz erantzun zuen. Besteak baietz. Biek zituzten datuak.

Lehen ikerketak, sagu-garuneko mitokondrioetan egindakoak, tindagaiak ezin duela egin ondorioztatu zuen. Bigarrenak, hiru karraskari-espezieren garuneko mitokondrioetan egindakoak, neurri batean egin dezakeela ondorioztatu zuen. Hirugarren ikerketa bat, sagu-gibelean egindakoa, sarritan aipatzen da haiekin batera, baina beste zerbait aztertu zuen. Dagokion lekuan kokatuz gero, nahasmenaren erdia argitzen da.

Ez dago iragartzeko mekanismo unibertsalik. Hiru esperimentu daude, blokeatzaile, dosi eta neurketa desberdinekin. Irakurri baldintzak lehenik. Ondorioak hortik datoz.

Zer esan nahi duen hemen saihesteak

Elektroiak I. konplexutik sartzen dira katera (NADHtik) edo II. konplexutik (sukzinatotik); III. konplexutik igarotzen dira c zitokromora, eta gero IV. konplexutik oxigenora. Bidean sortutako gradientea erabiltzen du zelulak ATP ekoizteko.

Saihesbide bat dagoela esateak esan nahi du metileno urdinak elektroiak hartzen dituela blokeoaren aurretik, eta haren ondoren uzten dituela. Tindagai oxidatuak NADHtik edo katearen hasierako osagaietatik hartzen ditu elektroiak, leukometileno urdin bihurtuz; eta forma erreduzituak c zitokromoari ematen dizkio, edo katera itzultzen ditu. Transferentzia blokeoaren ondoren gertatzen bada, arnasketa eta mintz-potentziala partzialki leheneratzen dira. Blokeoaren parean edo aurretik gertatzen bada, ez da ezer leheneratzen.

III. konplexuaren xehetasun batek baldintzatzen du eztabaida honen zati handi bat. Konplexuak Q zikloa egiten du, inhibitzaileak lotzeko bi gunerekin. Antimizina Qi guneari lotzen zaio. Mixotiazola Qo guneari lotzen zaio. Horietako bakarra erabiltzen duen ikerketa batek konplexuaren erdia baino ez du aztertu.

Lehen ikerketa: saihesbiderik ez sagu-garuneko mitokondrioetan

Gureev eta lankideek C57BL/6 saguen garun-azaleko mitokondrioak erabili zituzten, digitoninaz isolatuak, ml-ko 0.1 mg proteina erabiliz saiakuntzetan. Hiru substratu-baldintza erabili zituzten: pirubatoa eta malatoa, bakoitza 5 mM-ko kontzentrazioan; sukzinatoa 10 mM-ko kontzentrazioan, glutamatoarekin 2 mM-ko kontzentrazioan; eta L-prolina 10 mM-ko kontzentrazioan. Blokeatzaileak rotenona, 1 micromolar-eko kontzentrazioan (I. konplexua), eta antimizina, ml-ko 1 microgram-eko kontzentrazioan (III. konplexua), izan ziren. Tindagaiaren dosiak 0.5, 1 eta 2 micromolar izan ziren; kontzentrazio nagusia 1 micromolar izan zen. Metodoak eta erregistroak FEBS Letters aldizkariko komunikazioan daude.

I. konplexuaren saihesbideak funtzionatu zuen. Rotenonak ADPk estimulatutako arnasketa minutuko eta mg-ko 121 nmol ingurutik 2 nmol ingurura murriztu zuen, eta 1 micromolar-eko tindagaiak 21 ingurura igo zuen berriz. Mintz-potentziala leheneratu egin zen pirubatoarekin eta malatoarekin, baita L-prolinarekin ere.

III. konplexuaren saihesbideak ez zuen funtzionatu. Antimizinak arnasketa 16 ingurura murriztu zuen, eta tindagaiak 20 ingurura baino ez zuen igo. Mintz-potentziala ez zen leheneratu ezein substraturekin, ezta tindagaiaren dosiak 5 micromolar-eraino igota ere. Peroxidoaren datuek norabide bera erakutsi zuten: tindagaiak bakarrik peroxido-emisioa minutuko eta mg-ko 76 pmol inguruko tasa basaletik gutxi gorabehera 1170, 1460 eta 1945era igo zuen hiru dosietan; baina antimizinak tindagaiak eragindako seinale hori ehuneko 25, 88 eta 96 inguru murriztu zuen, hurrenez hurren. Tindagai erreduzituak oxigenoarekin zuzenean erreakzionatuko balu, III. konplexua blokeatzeak ez luke seinalea murriztu behar. Egileek ondorioztatu zuten tindagai erreduzitua III. konplexuaren Qo gunean oxidatzen dela, antimizinaren blokeoaren aurretik. Begizta laburra, hitzez: emaileetatik tindagaira, tindagaitik Qo gunera, eta handik aurrera ohiko bidetik. Rotenona saihesten da. Antimizina ez.

Bigarren ikerketa: saihesbide partziala hiru espezietan, inhibitzaileen bi guneetan

Svab eta lankideek diseinua zabaldu zuten. Sagu, arratoi eta akurien garuneko mitokondrioak erabili zituzten, Percoll bidez isolatuak, ml-ko 0.1 mg-ko kontzentrazio berean saiatuak, pirubatoarekin eta malatoarekin edo glutamatoarekin eta malatoarekin, bakoitza 5 mM-ko kontzentrazioan. III. konplexuaren bi blokeatzaile erabili zituzten: A antimizina 0.3 micromolar-eko kontzentrazioan, eta mixotiazola 1 micromolar-eko kontzentrazioan. Tindagaiaren kontzentrazioa 2 micromolar izan zen saiakuntza gehienetan, eta 0.5 c zitokromoarekin egindako lanean. Hiru espezieak, protokolo parekatuekin, sarbide irekiko artikuluan daude.

Bi blokeoak partzialki saihestu ziren, hiru espezietan. Sagu-mitokondrioetan, antimizinak arnasketa murriztu zuen, eta tindagaiak ehuneko 60 inguru igo zuen, minutuko eta mg-ko 37 nmol ingurutik 59ra. Mixotiazolak ehuneko 88 murriztu zuen, 4.5 ingurura, eta tindagaiak bost aldiz igo zuen, 23 ingurura. Mintz-potentziala partzialki birpolarizatu zen bi inhibitzaileekin; bi tindagairekin neurtu zen (O safranina eta TMRM erratiometrikoa), artefaktu optikoak baztertzeko.

Artikulu honek transferentzia zuzenean ere aztertu zuen, lehen ikerketak inoiz egin ez zuena. 25 micromolar-eko kontzentrazioan gehitutako c zitokromo azetilatu exogenoa ez zuten erreduzitu mitokondrio energizatuek, ez inhibitzaileekin ez haiek gabe; baina tindagaia gehitzeak erredukzioa eragin zuen bi kasuetan. Zelularik gabeko tanpoian, NADHk eta tindagaiak c zitokromoa erreduzitu zuten, NADHren kontzentrazioarekiko proportzionala zen abiaduran. Jauzi luzeagoa, hitzez: baliokide erreduzitzaileetatik tindagaira, tindagaitik zuzenean c zitokromora, eta IV. konplexutik oxigenora. Bide horrek III. konplexua guztiz saltatzen du; beraz, bi blokeatzaileak saihestu daitezke.

Beste bi neurketak interpretazio hori babesten dute. NAD(P)Hren fluoreszentzia jaitsi egin zen tindagaia mixotiazolarekin tratatutako mitokondrioei gehitzean; horrek esan nahi du baliokide erreduzitzaileak bide berritik bideratu zirela. Gainera, tindagaiaren 660 nm-ko absorbantziak gehikuntza bakoitzaren bilakaera erakutsi zuen; zentrifugatutako gaineko jariakinek, berriz, erakutsi zuten tindagai oxidatuaren kontzentrazioa ehun aldiz baino gehiago handitzen zela mitokondrio energizatuen barruan, eta gero haietatik ateratzen zela potentziala kolapsatzen zenean. Protoien balantzea ere bat dator: ponpaketa-urratsak saltatzeak elektroi-pare bakoitzeko 2 protoi inguru uzten ditu, 10en ordez. Beraz, oxigenoa azkarrago erabiltzea baina birpolarizazioa partziala soilik izatea benetako saihesbide bati dagokiona da, ez haren aurkako ebidentzia.

Prestakin berak azaleko irakurketa engainagarri bihurtzen duten erantzunak eman zituen. Inhibitzailearekin eta tindagaiarekin, ADPk arnasketa jaitsi zuen, igo beharrean; eta garraioa blokeatzeak estimulatu egin zuen, moteldu beharrean. Mintz-potentziala, ordea, ohiko norabideetan aldatu zen. Sistema honetan, oxigeno-kontsumoa bakarrik kontuan hartzeak engainatu egiten du.

Hirugarren ikerketa: I. eta II. konplexuak aztertu zituen gibeleko ikerketa, ez III.a

Lee eta Boelsterlik sagu-gibeleko mitokondrioak eta kultibatutako hepatozitoak erabili zituzten, efavirenzak (I. konplexua, IC50 30 micromolar ingurukoa) eta hidrazinak, isoniazidaren metabolitoak (II. konplexua, IC50 30 micromolar ingurukoa), kaltetuak. 30 micromolar inguruko tindagaiak NADHren oxidazioa, mintz-potentziala eta ATP leheneratu zituen, oxidatzaileak eta heriotza nekrotikoa murriztearekin batera. Redox Biology aldizkariko artikuluak proposatzen duen ereduan, tindagaiak elektroiak garraiatzen ditu kaltetutako I. eta II. konplexuak saihestuz.

Emaitza hori katearen aurreko zatirako onartutako testuingurua da, eta ez du ezer esaten III. konplexuari buruz, han ez baitzen ezer blokeatu. Ezin du garuneko bi ikerketetako bat ere baieztatu edo gezurtatu.

Baldintzen matrizea

III. konplexuari buruzko bi ikerketak beren baldintzetan zuzen egoteko lau arrazoi

1. Blokeatzailearekin egindako esku-hartzea ez zen bera. Antimizina bakarrik, ml-ko 1 microgram-eko kontzentrazioan, alderatuta antimizinarekin 0.3 micromolar-eko kontzentrazioan eta Qo gunearen beste blokeatzaile batekin. Elektroiak Qo gunera bideratzen dituen tindagaiaren bideak huts egiten du, hain zuzen ere c zitokromora zuzenean doan bideak arrakasta duen tokian. Gune bakarrak ezin ditu biak ordezkatu.

2. Tindagaiaren dosia eta denborak desberdinak ziren. Kontzentrazio nagusiak 1 eta 2 micromolar ziren, eta redox-zikloetan parte hartzen duen substantzia baten barneratzea eta c zitokromoaren zuzeneko erredukzioa kontzentrazioaren eta denboraren araberakoak dira. Dosi-alde txikiek eta neurketak une desberdinetan egiteak sare bereko adar desberdinak agerian utz ditzakete.

3. Prestakinak desberdinak ziren. Digitoninaz isolatzeak eta Percoll gradientearen bidez isolatzeak gainjartzen diren baina berdin-berdinak ez diren mitokondrio-populazioak hautatzen dituzte. Proteina-kontzentrazioa berdina zen, ml-ko 0.1 mg; beraz, aldagai hori bazter daiteke, baina ez azpipopulazioa eta osotasuna. Gainera, espeziea ez zen azalpena: bigarren taldeak saguan ere erreproduzitu zuen bere fenotipoa.

4. Substratuaren egoerak zehazten du tindagaiak zer egin dezakeen. Hiru substratu-baldintza, NADHri lotutako bikoteen aldean. NADHren hornidurak eta mintz-potentzialak elkarrekin zehazten dute tindagaia zer abiaduratan erreduzitzen den eta non banatzen den. Tindagai erreduzitua c zitokromo oxidatuaren ondoan behar duen bidea hautaketa horren menpe dago.

Nola irakurri saihesbide bati buruzko hurrengo baieztapena

Galdetu zein konplexu blokeatu zen, zein inhibitzailerekin, zein gunetan eta zein dositan. Galdetu tindagaiaren kontzentrazioa eta neurketa noiz egin zen. Galdetu ehuna, espeziea, isolamendua, proteina-kontzentrazioa eta substratua. Eta galdetu ea potentziala, arnasketa, redox-egoera eta transferentzia zuzeneko saiakuntza bat datozen; izan ere, hemen oxigeno-kontsumoak bakarrik behin baino gehiagotan norabide okerra iradoki zuen.

Laburpen mugatuak bere horretan dirau. Onartuta dago tindagaiak I. konplexua saihesten duela. III. konplexuaren kasuan, ml-ko 1 microgram antimizina eta 1 micromolar tindagai dituzten sagu-mitokondrioek ez dute saihesbide funtzionalik erakusten; aldiz, 0.3 micromolar antimizina edo 1 micromolar mixotiazol eta 2 micromolar tindagai dituzten hiru espezieek saihesbide partziala erakusten dute, tindagaitik c zitokromora zuzeneko transferentziarekin. Bi esaldi horiek bateragarriak dira. Hortik haragoko edozer estrapolazioa da.

Lotutako irakurgaiek eztabaidatutako baieztapena eztabaidarik gabeko kimikaren barruan kokatzen dute: metileno urdinak elektroiak nola mugitzen dituen, transferentzia-katea ulertzeko; I. konplexuaren saihesbideari buruzko esperimentuak, katearen aurreko zatiko kasu onartua ezagutzeko; mintz-potentzialaren neurketak eta haien artefaktuak, bi tindagai zergatik behar ziren ulertzeko; eta redox-zikloetan parte hartzen duten substantzien laborategiko manipulazioa, dosiaren eta denboraren inguruko tranpak ezagutzeko.