Artikulua
Metileno-urdina eta ferroptosia: burdina, lipidoen peroxidazioa eta zelula-heriotza
Ferroptosia mintzaren kalteak eragindako zelula-heriotza da. Mintzetako gantz poliasegabeak kate-erreakzio batean oxidatzen dira, mintzak huts egiten du eta zelula hil egiten da. Burdina beharrezkoa da prozesu kimiko horretarako. Esaldi horrek kontzeptu osoa biltzen du, eta artikulu honetako guztia haren zati bat probatzeko saioa da.
Hemen galdera zehatzagoa da: zer egiten dio metileno-urdinak kate horri zelula-esperimentuetan, eta zer erakusten du benetan emaitza horrek? Erantzun laburra da laborategiko bi ikerketatan kontzentrazio nanomolarreko metileno-urdinak lipidoen peroxidazio mitokondriala murriztu zuela eta zelulak bizirik mantendu zituela, bestela ferroptosia eragiten duten eragileak aplikatu ondoren. Erantzun luzeagoa garrantzitsuagoa da, kateko lotura bakoitza esku-hartze desberdin batekin probatu baitzen, eta esku-hartze bakoitzak bere mugak baititu.
Ferroptosia paragrafo batean
Gantz-azido poliasegabe baten isatsa duen mintzeko fosfolipido batek puntu ahul bat du: erraz kentzen zaizkion hidrogeno-atomoak. Erradikal batek horietako bat kentzen duenean, oxigenoa lipidoari gehitzen zaio, lipido-peroxilo erradikal bat sortzen da, eta erradikal horrek hurrengo lipidoari kentzen dio hidrogenoa. Erreakzioa mintzean zehar hedatzen da, zerbaitek geldiarazten ez badu.
Geldiarazteko mekanismo nagusia GPX4 izeneko entzima bat da; glutationa erabiltzen du lipido-peroxidoak erreduzitzeko eta kalterik gabeko lipido-alkohol bihurtzeko. Laborategiko eragileek defentsa horri puntu jakinetan erasotzen diote. Erastinak xc-minus sistemaren bidezko zistinaren sarrera blokeatzen du, eta, horren ondorioz, zelulak ez du glutationa sintetizatzeko behar duen zisteinarik. Butionina sulfoximinak zuzenean blokeatzen du glutationaren sintesia. RSL3k GPX4 bera inhibitzen du. Hirurek peroxidoak ezabatu gabe uzten dituzte, baina urrats desberdinetan egiten dute; beraz, eragile batekin lortutako emaitza ezin da automatikoki besteetara orokortu.
Ferroptosia apoptositik bereizten da hura definitzen duten ezaugarriengatik. Ez dago kaspasa-kaskadarik, ezta gorputz apoptotikorik ere. Deferoxamina bezalako burdinaren kelatzaileek eta ferrostatina-1 bezalako erradikal-harrapatzaileek ferroptosia eragozten dute; hori da ikertzaileek heriotza bat ferroptotikoa dela, eta ez soilik nekrotikoa, esateko erabiltzen duten proba operatiboa. Zelula-heriotza erregulatuaren bideen ikuspegi zabalagoak bereizketa hori testuinguruan kokatzen du, eta zelulek burdina labila nola kudeatzen duten jakiteak azaltzen du zergatik den kelazioa hain kontrol erabakigarria.
Non sartzen diren mitokondriak, eta zergatik eztabaidatu zen hori
Lehen ikerketek jakinarazi zuten DNA mitokondrialik gabeko zelulek ere ferroptosia jasaten dutela; horrek iradokitzen zuen mitokondriak ez direla ezinbestekoak. Ondorengo ikerketek aurkitu zuten mitokondriak agortzeak edo arnasketa blokeatzeak zisteina-gabeziak eragindako ferroptosia eragotz dezakeela, baina ez GPX4ren inhibizio zuzenak eragindakoa. Bi emaitzak egiazkoak izan daitezke mitokondrien ekarpena eragilearen, zelula motaren eta peroxidazio erabakigarria gertatzen den lekuaren araberakoa bada.
Artikulu honen oinarri den ikerketak konpartimentu espezifiko baterako zunda batekin heldu zion eztabaidari. MitoCLox lipidoen peroxidazioaren adierazle baten mitokondrietara zuzendutako bertsioa da: haren fluoreszentzia aldatu egiten da mitokondrien barruko lipido-peroxilo erradikalekin topo egiten duenean. Erastinarekin tratatutako fibroblastoetan, zunda mitokondrialaren oxidazioa oraindik bizirik zeuden zeluletan agertu zen, heriotzaren aurretik, eta heterogeneoa izan zen zelula-populazioan. Denbora-sekuentzia hori garrantzitsua da. Heriotzaren aurretik gertatzen den peroxidazioa kausa izan liteke. Hildako zeluletan soilik neurtutako peroxidazioa hondarra da. Lipidoen peroxidazioaren saiakuntzei eta zunda bakoitzak zer adierazten duen azaltzen duen gida osagarri batek azaltzen du zergatik erabakitzen duen zundaren kokapenak seinale baten esanahia.
Eredu bera agertu zen bigarren zelula-eredu batean. Leberren neuropatia optiko hereditarioa zuen paziente baten fibroblastoak —I konplexuko mutazio bat eta oinarrizko estres oxidatibo handiagoa zituztenak— ferroptosiaren bidez hil ziren glutationa agortu zenean; kontroleko fibroblastoek, berriz, eutsi egin zioten. Zunda mitokondrialaren oxidazioa izan zen berriro lehenengo gertakaria. Xehetasunak ferroptosian lipidoen peroxidazio mitokondriala fibroblastoetan aztertu zuen ikerketan daude.
Zer aldatu zuen metileno-urdinak esperimentu hauetan
Metileno-urdina redox garraiatzailea da. Haren forma oxidatuak I konplexuko NADHri lotutako prozesu kimikoetatik elektroiak hartzen ditu, eta forma erreduzituak c zitokromoari ematen dizkio; hark IV konplexua elikatzen du. Horrek saihesbide partzial bat sortzen du katearen segmentu baten inguruan, non elektroiak normalean oxigenora ihes egiten duten eta superoxidoa sortzen duten. Transferentzia-sekuentzia osoa ezagutu nahi duten irakurleek metileno-urdinak elektroiak mitokondrietan zehar nola mugitzen dituen azaltzen duen artikulutik hasi beharko lukete.
Erastinarekin tratatutako biriketako fibroblastoetan, 250 nanomolar kontzentrazioko metileno-urdinak bideragarritasuna mantendu zuen zelulen biziraupena neurtzen zuen saiakuntza batean, mitokondrietara zuzendutako SkQ1 eta MitoTEMPO antioxidatzaileekin batera. Kontrolek zehazten dute baieztapenaren irismena. Ferrostatina-1ek, alfa-tokoferolak eta deferoxaminak ere babesa eman zuten, eta horrek heriotza ferroptotikoa zela berresten du. Talde antioxidatzailerik gabeko SkQ1en analogoak ez zuen babesik eman; horrek redox kimikara jotzen du azalpen gisa, eta ez metaketa ez-espezifikora. SkQ1en kontzentrazioak gutxi gorabehera 200 nanomolar gainditzean, babesa ahuldu egin zen; hori bat dator kinona antioxidatzaileek karga handiagoetan duten portaera prooxidatzaile ezagunarekin. Metileno-urdinak ere dosiaren araberako portaera bikoitz hori du: kultibo-ontzi hauetan maila nanomolar baxuetan babesa ematen du, baina hidrogeno peroxidoa sor dezake redox zikloen bidez kontzentrazioa handitzen denean edo argi biziaren eraginpean jartzen denean. Dosiaren inguruko testuinguru hori mitokondrietako oxigeno-espezie erreaktiboei buruzko artikuluan azaltzen da.
Ondoren, mitokondria isolatuekin egindako esperimentuek ROSen iturriak bereizi zituzten. Burdina ferrosoa zegoenean, I konplexua elikatzen zuten substratuek eta rotenonak zundaren oxidazioa estimulatu zuten. Rotenonak flavina-gunearen ondorengo urratsa blokeatzen du; beraz, aurreko garraiatzaileak erreduzituta mantentzen dira, eta matrizera begira dagoen flavinatik elektroiak oxigenora ihes egiten dute. III konplexua elikatzen zuten substratuek eta antimizina Ak hidrogeno peroxido ugari sortu zuten, baina ez zuten lipidoen peroxidazioa bultzatu. ROSen seinale orokor bera, kokapen desberdina, emaitza desberdina. SkQ1ek eta metileno-urdinak I konplexuak bultzatutako peroxidazioa eragotzi zuten, hidrogeno peroxidoaren ekoizpena bera eragotzi gabe; horrek ROSak sortu ondoren kokatzen du haien ekintza, lipidoen peroxidazioaren urratsean.
Burdina-gainkargaren azterketa eta lipofuszinaren arrastoa
Bigarren ikerketa batek burdinaren ikuspegitik planteatu zuen galdera. Kontzentrazio submilimolarreko amonio zitrato ferrikoaren eraginpean jarritako H9c2 kardiomiozitoetan ROS mitokondrialak agertu ziren, gero lipidoen peroxidazio mitokondriala eta ondoren ferroptosia; jarraian, lipofuszinaren antzeko pigmentu bat metatu zen 24 orduren barruan. Lipofuszina lipido eta proteina oxidatuen hondar autofluoreszentea da, burdina duena eta adinarekin metatzen dena; hemen azkar agertzeak burdinak bultzatutako peroxidazio akutua zahartzearen markatzaile klasiko batekin lotzen du. Kontzentrazio nanomolarreko metileno-urdinak eta SkQ1ek peroxidazioa, heriotza eta pigmentuaren metaketa eragotzi zituzten. Bihotzeko mitokondria isolatuek eredua berretsi zuten: rotenonak eta burdina ferrosoak peroxidazioa eta pigmentuaren antzeko seinalea bultzatu zituzten, eta bi agenteek blokeatu egin zituzten. Sekuentzia osoa H9c2 kardiomiozitoetan burdina-gainkarga aztertu zuen ikerketan jasota dago. Pigmentuaren alderdia lipofuszinarekin eta zelula-zahartzearen markatzaileekin batera aztertu behar da.
Zer ez duten erakusten zelulen biziraupen-saiakuntzek
CellTiterBlue bezalako bideragarritasun-neurketa batek adierazten du kultibo-ontzi batean zenbat zelula mantentzen diren metabolikoki aktibo, eragile bat eta babesle izan litekeen substantzia bat aplikatu ondoren. Sistema zehatz batean mekanismo bat probatzeko modua da. Ez da tratamendu baten emaitza. Esperimentu horietako bakar batean ere ez zitzaion paziente bati dosirik eman, ez zen gaixotasun bati lotutako emaitza-adierazlerik neurtu, eta ez zen organismo batean tarte terapeutikorik ezarri.
Lau muga esplizituki adierazi behar dira. Lehenik, zelula moten sorta mugatua da: biriketako fibroblasto eraldatuak, larruazaleko fibroblasto primarioak —gaixotasun mitokondrial bat duen lerro bat barne— eta arratoi-kardiomiozitoen lerro bat, baita arratoien bihotzetik isolatutako mitokondriak ere. Sentikortasuna lerroaren arabera aldatu zen, eta LHON lerroa bereziki kaltebera zen, ikerketaren diseinuagatik. Bigarrenik, eragileak laborategiko muturreko baldintzak dira: garraioaren edo sintesiaren erabateko blokeoa, eta ehunek modu akutuan jasango ez lituzketen burdina-kargak. Hirugarrenik, kontzentrazioa ez da dosi bihurtzen biderketa hutsez. Kultibo-medio bateko kontzentrazio nanomolarra ez da giza dosi bat, eta metileno-urdinaren banaketa, odolean eta ehunetan forma koloregabera erreduzitzea, argiarekiko esposizioa eta mintz-potentziala kultibo-ontzi baten eta pertsona baten arteko faktoreak dira. Laugarrenik, zundek beren konpartimentuari buruzko informazioa ematen dute. MitoCLoxen oxidazioak erakusten du lipido-erradikal mitokondrialak sortu zirela; ez du erakusten mintz plasmatikoaren haustura, ziurrenik azken gertakaria dena, zuzenean eragotzi zenik, aurreko urratsetan saihestu beharrean.
Beraz, baieztapen zintzoa hau da: eredu hauetan, I konplexutik eratorritako ROSek eta burdinak ferroptosiaren aurretik gertatzen den lipidoen peroxidazio mitokondriala bultzatzen dute, eta kontzentrazio baxuko metileno-urdinak segmentu hori eteten du. Segmentu horretatik harago doan edozer baieztatzeko, bestelako esperimentuak behar dira animalietan, eta ondoren pertsonetan.