Metüleensinise ajalugu: värvainest ravimiks ja teadusuuringute objektiks

Metüleensinine jõudis patsiendini enne, kui see jõudis apteeki.

Paul Guttmanni ja Paul Ehrlichi 1891. aasta aruanne värvaine kasutamisest malaaria puhul sisaldab kahte temperatuurigraafikut. Teine hõlmab ajavahemikku 13. juulist 5. augustini ning iga päeva ravi on märgitud graafiku servale. 18. ja 19. juuli sissekannetes seisab "1 × 0,05 Methylenblau". Järgnevatel päevadel on märgitud viis ja seitse sama koguse annust ning 22. juuliks on dokumenti lisandunud väike kogus kiniini. Palavikukõver, mis kõigub graafiku esimeses pooles 37 °C ja 39.5 °C vahel, tasandub pärast värvaine kasutuselevõttu ning püsib ülejäänud kolme nädala jooksul umbes 36 °C ja 37.5 °C vahel.

Patsient oli üks kahest; artiklis kirjeldati neid koduteenija ja meremehena. Neile manustatud ühend oli olnud viisteist aastat kaubanduslik tekstiilivärv ning need kaks meest kuuluvad esimeste dokumenteeritud inimeste hulka, keda raviti täielikult sünteetilise ravimiga, mis oli suunatud konkreetse organismi vastu.

Kõigepealt tuli värvaine

Esimese kaubanduslikult eduka sünteetilise värvaine lõi William Henry Perkin 1856. aastal. Perkin oli kaheksateistkümneaastane, töötas lihavõttepühade ajal kodulaboris ja püüdis sünteesida kiniini. Selle asemel sai ta musta jäägi, lahustas selle ja avastas värvi, mis kinnistus siidile erakordselt hästi. Ta patenteeris selle 1856. aasta augustis ning 1857. aasta lõpuks varustas tema tehas üht Londoni siidivärvimistöökoda.

• aastal sünteesis Adolf von Baeyer punase värvaine ja nimetas selle eosiiniks, kreekakeelse koidujumalanna Eose järgi. 1876. aastal töötas tollane Badische Anilin- und Soda-Fabriku laboridirektor Heinrich Caro koos Baeyeriga välja metüleensinise kui aniliinipõhise värvaine puuvilla jaoks. Selle keemiline struktuur sai lõplikult selgeks alles umbes üheksa aastat hiljem.

See päritolu on endiselt nähtav aine nimetuses. "Metüleensinine" on värvainete kataloogist pärinev kaubanimi, mitte keemiline kirjeldus. Ühend, millele see viitab, on metüültioniiniumkloriid ning erinevused nimetuse, soola ja selle hüdraatide vahel muutuvad oluliseks niipea, kui keegi ainet kaalub või spetsifikatsiooni loeb.

Värvimine oli sillaks

Tee värvitehasest haiglasse kulges läbi mikroskoobi ja algas enne metüleensinise olemasolu. Wilhelm Erb oli esimene, kes kasutas vere uurimisel sünteetilist värvainet: 1865. aastal kasutas ta pikriinhapet ja nägi mõne punaverelible sees retikulaarset mustrit.

Paul Ehrlichi 1878. aasta doktoritöö võrdles histoloogilist värvimist tekstiilide värvimisega ning väitis, et mõlemad on keemilised reaktsioonid. Töötades Robert Kochi juhendamisel tuberkuloosibatsilliga, jaotas ta aniliinvärvid happelisteks ja aluselisteks ning tegi kindlaks, et kumbki klass värvib raku eri osi. 1880. aastal segas ta need kaks kokku: küllastunud metüleensinise lahus valati happelisse fuksiini, kuni pealiskihis olev vedelik muutus selgeks. Tulemus, mida ta nimetas neutralen Farbkörper ehk neutraalseks värviks, andis ühe värvi asemel kolm, tõi esile polümorfonukleaarsete rakkude graanulid, mida varem polnud nähtud, ning võimaldas esimest korda teha leukotsüütide diferentsiaalloendust. Kuna need graanulid sidusid segu mõlemat komponenti, lõi Ehrlich neid kandvate rakkude jaoks termini neutrofiil.

Kaks aastat hiljem kasutas Koch metüleensinist tuberkuloosibatsilli leidmiseks ning 1883. aastal täiustas Ehrlich meetodit. 1886. aastal avaldas ta teistsuguse vaatluse: ta süstis värvainet elusloomadele, võrdles, kui tugevalt eri elundid seda sidusid, ja järeldas, et ainel on märgatav afiinsus aju- ja närvikoe suhtes. Ta seostas seda afiinsust värvaine oksüdatsiooni-reduktsiooni tsükliga, mida ta oli täheldanud eelmisel aastal. Sama tsükkel selgitab ka seda, miks metüleensinise lahus kaotab värvi, kui selle hapnik ära tarbitakse, ning saab värvi tagasi, kui õhk uuesti ligi pääseb. Katsed, milles esimest korda mõõdeti selle tsükli tagajärgi, kuuluvad hilisemasse kümnendisse ning mehhanism ise on ajaloost eraldi teema.

Parasiit ja lilla tuum

Alphonse Laveran leidis malaariaparasiidi 1880. aastal, uurides värsket värvimata verd. Selle korrapäraseks nägemiseks kuivatatud äigepreparaadis oli vaja värvainet ning tolleaegsed värvimismeetodid andsid ainult punase ja sinise värvuse.

• aastal asendas Poola patoloog Czesław Cheçinski happelise fuksiini eosiiniga, saades metüleensinise ja eosiini segu. Tema meetodi aluseks olnud juhtum puudutas sõdurit, kes suri malaariasse 30. septembril 1887. Verepreparaatides nägi Cheçinski siniseid karikakrataolisi vorme, mida praegu tuntakse kui Plasmodium malariae, ning sirbikujulisi vorme, mida praegu tuntakse Plasmodium falciparum'i gametotsüütidena. Tulemus lükkas korraga kõrvale kaks konkureerivat haiguse seletust: miasmiteooria ning Edwin Klebsi ja Corrado Tommasi-Crudeli väite, et malaariat põhjustab bakter.

Parasiit oli nähtav. Selle tuum mitte, mistõttu jäi organismi olemus lahtiseks. Breslau arst Ernst Malachowski lahendas selle probleemi esmalt juhuslikult ja seejärel sihipäraselt. 1889. aastal märkas ta ühes preparaadis plasmoodiumi tuuma diferentsiaalset värvumist, kuid ei suutnud tulemust korrata. Metüleensinise hapestamine ei aidanud. Selle leelistamine booraksiga andis efekti iga kord. Ta demonstreeris tehnikat avalikult 15. juunil 1890 ja avaldas selle samal aastal, põhjalikuma meetodi aga 1891. aasta augustis.

Dmitri Romanowsky avaldas oma versiooni 1891. aasta septembris. Tema parimad tulemused pärinesid hooletusse jäetud, hallitanud metüleensinise lahuse pudelist, mis oli üle kahe kuu vana. Malachowski kirjeldus oli teadlikult välja töötatud ja tema sõnul kergesti korratav; Romanowsky oma oli ummiktee, mis toimis ühe korra. Eponüüm läks sellest hoolimata Romanowskyle ning vaidlus selle üle, kes tekitas lilla värvuse, mis muutis tuuma nähtavaks, on eraldi lugu oma dokumentidega.

Joonis: Guttmanni ja Ehrlichi 1891. aasta aruande teine temperatuurigraafik. Ülemine paneel hõlmab 13.–24. juulit ja alumine 25. juulist 5. augustini; servamärkustes on nimetatud manustatud annused ning temperatuur püsib vaatlusperioodi viimase kolme nädala jooksul normilähedane. Reprodutseeritud aruandest, mis skaneeriti Kraftsi, Hempelmanni ja Skórska-Stania artikli jaoks ajakirjas Parasitology Research* 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Selgus, et „küpsemine” oli demetüleerimine

Keegi 1890. aastatel tegutsenutest ei teadnud, mida „küpsemine” metüleensinisega teeb. Vastus tuli tööstuskeemiast. Heinrich August Bernthsen oli 1883. aastal sünteesinud lähteühendi fenotiasiini, teinud 1885. aastal kindlaks, et metüleensinine kuulub sellesse perekonda, ning näidanud samal perioodil, et leeliselised tingimused eemaldavad värvainest metüülrühmi, tekitades ühendid, mida nüüd nimetatakse asuurideks.

Bernard Nocht eraldas aktiivse fraktsiooni 1898. ja 1899. aastal ning sai seda nimetada ainult Rot aus Methylenblau, metüleensinisest saadud punaseks. Michaelis tuvastas selle 1901. aastal azure I-na. Jenner võttis 1899. aastal värvisademe lahustina kasutusele absoluutse metanooli, mis kõrvaldas vajaduse verepreparaate kuumutamisega fikseerida; Leishman ja Reuter ühendasid mõlemad edusammud; Wright avaldas 1902. aastal lihtsustatud meetodi. Giemsa panus, samuti 1902. aastal, seisnes selles, et juhuslikult küpsenud lahusele tuginemise asemel hakati kasutama teadaolevate värvainete mõõdetud koguseid. Seejärel keeldus ta avaldamast, kuidas ta valmistas puhast metüleenasuuri, ning müüs meetodi Dr. Grübleri laborile, mis turustas toodet nime all azure I ja väitis, et ainult selle versioon oli ehtne Giemsa värv.

Kaks maailmasõda viisid selle töö juhuslikult lõpule. Kui Saksa värvained muutusid kättesaamatuks, uurisid Lillie, Roe ja Wilcox Ameerika asendusaineid ning leidsid, et parima värvumise andsid kolm eraldatud komponenti: puhas metüleensinine, selle laguprodukt azure B ja eosiin. Need kolm on siiani tänapäeval malaaria diagnoosimiseks kasutatava värvi põhikomponendid nime all, mis ühendab nüüd Malachowski, Wrighti ja Giemsa.

Joonis: Plasmodium falciparum*'i rõngasvormid inimese punaverelibledes, värvitud Romanowsky-tüüpi meetodiga. Rõnga sees olev lilla struktuur on kromatiin, mille Malachowski booraksiga töödeldud metüleensinine esimest korda nähtavaks muutis. Pilt: Ernst Hempelmann, avalikus omandis.

Üks nimi, mitu materjali

Aastad, mis kulusid nende komponentide eraldamiseni, jätsid maha probleemi, mis püsis keemiast kauem. Ralph Lillie tõmbas 1969. aastal piiri bioloogiliste värvainete, mis on „toodetud rangete spetsifikatsioonide järgi, mis vastavad nende tundlikule ja täpsust nõudvale kasutusele”, ning tekstiilide värvimiseks mõeldud mittebioloogiliste värvainete vahele, mis „nõuavad vähem rangeid ja vähem nõudlikke tootmisstandardeid”. Mõlemat tüüpi tooted kandsid sama nime ning nende erinevus ei olnud kunagi lihtsalt kvaliteeditaseme erinevus. Puuvilla jaoks koostatud spetsifikatsioon ja diagnostilise reagendi jaoks koostatud spetsifikatsioon ei ole omavahel asendatavad ning tekstiilispetsifikatsiooni järgi valmistatud materjal ei olnud mõeldud allaneelamiseks.

Azure B on kõige selgem näide. See on metüleensinise monodemetüülitud vorm, sellel on mõõdetav omaette farmakoloogiline aktiivsus ning see esines kliinilistes metüleensinise preparaatides kontrollimatu koostisosana üle sajandi, enne kui need kaks eraldati. Üks uurimisrühm leidis, et pärast metüleensinise manustamist lahangul võetud inimkoeproovid sisaldasid 5 kuni 14 protsenti muutumatul kujul metüleensinist ja 86 kuni 95 protsenti azure B-d. See, kas konkreetne preparaat peaks sisaldama azure B-d ja millise piirväärtusega, on spetsifikatsiooni küsimus ning uuringud azure B kui lisandi ja metaboliidi kohta jätkavad teemat sealt.

Spetsifikatsioon määrab ka praktilise tagajärje. USP nõuetele vastavus on tee turul pakutava suurima puhtuseni, sest tegemist on tervikliku avaldatud katsestandardiga, mitte ühe mõõtmisega. See hõlmab identsust, toimeainesisaldust, orgaanilisi lisandeid, sealhulgas asuurvärve, jääklahusteid, elementaarseid lisandeid, süütejääki, mikroobseid piirnorme ja bakteriaalseid endotoksiine. Sertifikaat, mis esitab raskmetallide tulemuse ja nimetab seda USP nõuetele vastavuseks, on esitanud sellest loetelust ühe rea.

Blupreme hangib oma metüleensinise ravimitootjalt ja avaldab täieliku analüüsisertifikaadi, testides kogu USP spetsifikatsiooni, mitte üksnes raskmetalle. Analüüsisertifikaadi lugemise juhend ja selgitus selle kohta, mida USP tähistus kinnitab ja mida mitte käsitlevad seda, kuidas dokumenti väitega võrrelda.

Mida ajalugu lubab järeldada ja mida mitte

Põlvnemisliin on tegelik ning pikem, kui enamik tootelehti mõista annab. Metüleensinist kasutati malaaria raviks 1891. aastal, 1899. aastal kirjeldati seda sedatiivina agiteeritud psühhoosi korral ning selle kõrvalahel viib läbi kinakriini, klorokiini, prometasiini ja kloorpromasiini. Ehrlichi 1890. aasta artikkel koos Arthur Leppmanniga kirjeldas neuralgilise ja reumaatilise valu leevenemist ning seejärel kaalus värvaine katsetamist vaimuhaiguste korral, kuid loobus sellest.

Ükski neist asjaoludest ei tõenda tänapäevast kasutusotstarvet. 1891. aasta malaaria tulemus põhines kahel patsiendil ja temperatuurigraafikul. Pikaajaline kokkupuude molekuliga annab põhjuse seda uurida, mitte tulemuse. Ühendi ajalugu ravimina ja tänapäevased malaariauuringud vastavad teistele küsimustele kui need, mida Ehrlich esitas, ning tulemusnäitajaid tuleb hinnata nende endi tingimustel.

Dokumentides on üks detail, mis kuulub pigem olevikku kui minevikku. Kui teadlased korraldasid 2000. aastatel Burkina Fasos metüleensinise malaariauuringuid, pidid nad konkureerima ravimikvaliteediga materjali pärast ning teatasid, et tooraine hind oli pärast GMP valideerimist tõusnud umbes sada korda. Värvainet sai asendada. Ravimit mitte. Piir, mille Lillie tõmbas 1969. aastal, on sama piir, mis määrab tänapäeval pudeli sisu.