Katsed, mis seostasid metüleensinise rakuhingamisega

Defibrineeritud inimveri, mida hoitakse kolm tundi temperatuuril 37 °C, tarbib ligikaudu kaks protsenti selles sisalduvast hapnikust. Kui enne inkubeerimist lisada väike kogus metüleensinist, tarbib sama veri ligikaudu kuuskümmend viis protsenti. Rakkudes endis ei muutunud midagi. Muutus ainult lahus.

See arv pärineb George Harropi ja E. S. Guzman Barroni 1928. aasta artiklist, mis valmis Johns Hopkinsis, ning sellest sai alguse laialt korratud väide, et metüleensinine parandab rakuhingamist. Väide ei ole vale, kuid selle tähendus on kitsam, kui esmapilgul paistab.

Mida tabelis olev arv tegelikult mõõdab

Mõõdetav lõppnäitaja oli hapniku omastamine, mis määrati gaasianalüüsiga. Harrop ja Barron filtreerisid värskelt võetud verd temperatuuril 10 °C läbi vati, et eemaldada valgeverelibled, küllastasid proovi hapnikuga, jagasid selle osadeks, lisasid ühele osale värvainet ning analüüsisid pärast inkubeerimist mõlemat. Leukotsüütide arv ületas harva umbes tuhandet kuupmillimeetri kohta. Hapnikutarbimine esitati osana proovi algsest hapnikusisaldusest, mis oli kadunud.

Nad mõõtsid ka süsinikdioksiidi, kuid siin osutus meetod takistuseks. Defibrineeritud veri vabastas esimesel inkubeerimistunnil kuni kaks millimooli süsinikdioksiidi 100 mL kohta põhjustel, mis ei olnud uuritava reaktsiooniga seotud, mistõttu täisvere hingamiskoefitsiendid olid kasutuskõlbmatud. Ainult pestud rakud Locke'i lahuses andsid tõlgendatavaid tulemusi ning need jäid nii värvainega kui ka ilma selleta vahemikku 0.73–0.80.

See detail pole kõrvaline. Nendes artiklites tähendab „hingamine” gaasivahetust suletud anumas. Hapnikutarbimise ja kasuliku energiatoodangu vahet käsitletakse eraldi artiklis mida hapnikutarbimine ATP kohta ütleb ja mida mitte.

Värvaine lisas kõige rohkem seal, kus rakud hingasid kõige vähem

Küpsete imetajaerütrotsüütide hapnikutarbimine on peaaegu mõõdetamatu. Tuumaga linnuerütrotsüüdid aga tarbivad hapnikku. Harrop ja Barron katsetasid mõlemaga ning nende erinevus on autorite arutluse selgroog.

Imetajate proovides suurendas värvaine hapnikutarbimist kakskümmend kuni viiskümmend korda. Haneveres, mille rakud juba hingasid, ei suurenenud kiirus kunagi rohkem kui kaks korda. Mida suurem oli esialgne hingamisaktiivsus, seda vähem sai värvaine juurde anda.

Sama suundumus ilmneb ka ühe liigi piires. Tõelise polütsüteemiaga patsiendi vereproov, mis sisaldas ebaküpseid rakke, tarbis ilma värvaineta 11.3 protsenti oma hapnikust, võrreldes terve doonori pestud rakkude 2.8 protsendiga. Värvaine viis selle vaid 63.4 protsendini: kuuekordne kiirenemine olukorras, kus normaalsete rakkude puhul oli kiirenemine ligi kolmekümnekordne. Värvaine muutis küpsete rakkude käitumise sarnasemaks ebaküpsete omaga, täpselt nagu autorid väitsid.

Tsüaniid oleks pidanud selle peatama

Oli teada, et tsüaniid peatab rakulise oksüdatsiooni. Harrop ja Barron lisasid seda siiski koos värvainega.

Veisevere tulemused on iseloomulikud. Ilma lisanditeta langes hapnikusisaldus kolme tunni jooksul 22.61-lt 22.03 mahuprotsendini. Metüleensinisega langes see 12.84-ni. Metüleensinise ja ühe viietuhandendiku molaarse kaaliumtsüaniidiga langes see 12.74-ni. Värvaine mõju jäi sisuliselt muutumatuks.

Joonis: inimese erütrotsüütide pidev mikrorespiromeetriline mõõtmiskõver. Nool tähistab metüleensinise lisamist. Enne seda on kõver peaaegu horisontaalne; pärast seda tõuseb see ühtlaselt. Reprodutseeritud Harropi ja Barroni artiklist, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Nende järeldus oli, et värvaine toimis hapnikukandjana, „varustades rakke ainega, mis on täiskasvanud imetajate tuumata erütrotsüütidest kadunud”. Kaks aastat hiljem sõnastasid Rockefelleri instituudi Michaelis ja Salomon lahkarvamuse kujul, mis jäi püsima. Värvaine mõju oli kas „värvaine juhuslik omadus” või oli värvaine „mudel mingile tundmatule ainele organismides”. Neid kahte võimalust pole lõplikult lahutatud. Muutunud on see, et rakke saab nüüd kirjeldada palju täpsemalt.

Maksaekstrakt tegi sama

Michaelis ja Salomon näitasid, et elundite külmavee-ekstraktid põhjustavad samasugust stimuleerimist. Kõige tugevam mõju oli roti maksal, millele järgnesid neer, põrn ja munand. Ajul, lihasel ja vereseerumil oli mõju väike või puudus üldse.

Seejärel katsetasid nad ekstrakti süsinikmonooksiidi juuresolekul. Nii ekstrakti kui ka värvaine esile kutsutud hingamine jäi muutumatuks segus, mis koosnes 98 protsendist süsinikmonooksiidist ja 2 protsendist hapnikust. Sama gaasisegu pärssis pärmi ning tuumaga kodulinnuerütrotsüütide hingamist ligikaudu 60 kuni 80 protsenti, kooskõlas Warburgi kirjeldusega süsinikmonooksiiditundlikust hingamisfermendist. Seega ei olnud tuvastamata koeaines Warburgi ensüüm.

Uurimise käigus langes ära mitu võimalikku kandidaati. Redutseeritud glutatioon ja tsüsteiin põhjustasid ainult hapnikutarbimist, mis oli vajalik nende endi oksüdeerumiseks. Hardeni ja Youngi koensüüm välistati, sest seda sisaldab kõige rohkem lihas, mille mõju oli peaaegu kõige väiksem. Mõni aasta varem nime saanud Keilini tsütokroomi puhul ilmnes sama vastuolu. Omaenda oletust, et toimeaine pärines rakutuumast, nimetasid nad pelgaks oletuseks.

Mõjul olid omad eeltingimused

Rakud pidid olema terved. Destilleeritud vee või korduva külmutamise põhjustatud hemolüüs kaotas reaktsiooni nii värvainele kui ka ekstraktile ning osaline hemolüüs vähendas seda proportsionaalselt.

Vaja oli ka suhkrut. Glükoos, fruktoos ja sahharoos toetasid värvaine esile kutsutud hingamist; mannitool mitte. Suhkru puudumisel ei toimunud hingamist üldse ning näis, et värvaine kahjustas seejuures rakke, mistõttu üks või kaks tundi hiljem lisatud glükoos hingamist ei taastanud. Autorid oletasid, et värvaine oksüdeeris rakule vajalikku struktuurset komponenti.

Valgustamine suurendas värvaine mõju märgatavalt, kuigi mõju oli selge ka pimedas. Teised redutseeritavad värvained käitusid erinevalt: tolüleensinise mõju oli metüleensinise omaga võrdne või suurem, indigodisulfonaat aga ei teinud peaaegu midagi. Värvaine oksüdatsiooni-redutseerimispotentsiaali ja selle mõju suuruse vahel ei ilmnenud selget seost; autorid seostasid seda membraani läbilaskvuse ja toksilisusega.

Mõju järgis käärimist, mitte hingamist

Barroni 1930. aasta uuring liikus rakususpensioonidelt normaalsete rotielundite ja siirdatud kasvajate koelõikudele.

Kudedes, kus aeroobset glükolüüsi ei toimunud, ei avaldanud metüleensinine mõju või pärssis hapnikutarbimist veidi: neerus umbes 14 protsenti, kõhunäärmes umbes 14 protsenti ja maksas umbes 5 protsenti. Kudedes, kus käärimine toimus hapniku juuresolekul, suurendas see tarbimist: põrnas umbes 8 protsenti ja ajus umbes 13 protsenti. Kasvajates ulatus suurenemine umbes 27 protsendist inimese rinnakartsinoomis rohkem kui 80 protsendini Rousi kanasarkoomis, ligikaudu proportsionaalselt iga koe aeroobse glükolüüsiga.

Joonis: iga punkt tähistab üht koetüüpi. Horisontaalteljel on aeroobne glükolüüs; vertikaalteljel hapnikutarbimise muutus pärast metüleensinise lisamist. Andmed Barroni artiklist, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), tabel 6, PMID 19869777.

Tsüaniidikatse andis seejärel peegelpildi. Kui nende varem mittereageerinud kudede hingamine blokeeriti tsüaniidiga ja käärimine tuli esile, suurendas värvaine taas hapnikutarbimist: neerus umbes 59 protsenti, maksas umbes 19 protsenti, põrnas umbes 286 protsenti ja munandis umbes 200 protsenti.

Barron pakkus välja, et värvaine võiks sobida raku või koe käärimisvõime hindamiseks, ning lõpetas oletusega: kasvajakultuuri järjestikused põlvkonnad värvainet sisaldavas söötmes võiksid ühel päeval muuta kasvaja ainevahetuse püsivalt normaalse koe omaga sarnaseks. See oli 1930. aastal esitatud uurimisküsimus. See ei ole raviväide.

Mida need katsed ei saanud mõõta

1928. ja 1930. aastal tähendas „hingamine” hapnikutarbimist. Adenosiintrifosfaadist teatati esimest korda 1929. aastal ning alles 1949. aastal näidati, et isoleeritud mitokondrid esterdavad fosfaati elektronide ülekandmise käigus. Ükski varane metüleensinise artikkel ei saanud mõõta energiatootmist ning ükski neist seda ka ei väitnud.

Teine probleem on rakud ise. Küpsed imetajaerütrotsüüdid ei sisalda mitokondreid. Retikulotsüüdi staadiumis eemaldavad nad mitokondrid ja ribosoomid selektiivse autofaagia abil, mistõttu küps punaverelible saab energiat glükolüüsist ning sõltub pentoosfosfaadirajast peamiselt NADPH, mitte ATP saamiseks. 1928. aasta katsetes polnud elektrontranspordiahelat, mida parandada. Hapnikku tarbiv protsess tegi midagi muud.

Nüüdseks on üsna hästi kirjeldatud, mis see muu oli. Metüleensinine võtab vastu elektrone raku redutseerivatelt ekvivalentidelt ja muutub leukometüleensiniseks, mille molekulaarne hapnik taas oksüdeerib, sulgedes tsükli. Inimese punaverelibledes viivad redutseerimisetapi läbi NADPH-sõltuv flaviinreduktaas ja sellega seotud disulfiidreduktaasid. 1976. aasta uuringus, kus kasutati märgistatud glükoosi, leiti, et värvaine stimuleerib heksoosmonofosfaadi rada, et väikese kontsentratsiooni korral sõltus mõju oksühemoglobiinist ning et suurem kontsentratsioon, 0.1 mM, tekitas vesinikperoksiidi. Redutseeritud värvaine kokkupuutel hapnikuga tekib peroksiid, mitte fosfaatsidemed.

Mitokondrites on pilt vaieldavam, kui populaarsed kokkuvõtted tunnistavad. Ühe uurimissuuna järgi võtab värvaine elektrone kompleksi I piirkonnast ja annab need tsütokroom c-le. Teises leiti, et hiire aju mitokondrites ei suuda see taastada hingamist pärast antimütsiiniga blokeerimist, ning elektronaktseptor paigutati hoopis kompleksi III ubikinooli sidumiskohta. Kolmandas leiti, et väikesed kontsentratsioonid suurendasid hapnikutarbimist puhkeolekus, jättes ADP-ga stimuleeritud hingamise muutumatuks. Kõige otsesemalt väljendab asja tuuma järeldus, et metüleensinise esile kutsutud hapnikutarbimine ei sõltu üldse oksüdatiivsest fosforüülimisest: see püsis nii hingamisahela pärssimise korral kui ka preparaatides, milles hingamisahel puudus.

Olemas on ka otsesed mõõtmised nende kahe suuruse lahknevuse kohta. Isoleeritud roti maksa mitokondrites vähendasid kasvavad värvainekontsentratsioonid hingamiskontrolli suhtarve ja põhjustasid paisumist, mida autorid kirjeldasid kui oksüdatiivse fosforüülimise lahtisidestamist. Perfundeeritud roti maksas suurendas metüleensinine hapnikutarbimist, samal ajal kui ATP ja ADP suhe langes.

Kliinilised andmed annavad sama sõnumi. Methemoglobineemiat ravitakse ligikaudu ühe kuni kahe milligrammi metüleensinisega kilogrammi kohta intravenoosselt, NADPH-sõltuva redutseerimisraja kaudu, ning suuremad annused põhjustavad seisundit, mida ravitakse. Sama ülevaade märgib, et antidoodina on mõju suurim tervetes erütrotsüütides ja väheneb hemolüüsi korral. Nii ilmub 1930. aasta hemolüüsi puudutav leid seitsekümmend kolm aastat hiljem uuesti haiglakontekstis. Ühendi puhul, mille kasulik ja kahjulik mõju jäävad annuseläve eri pooltele, ei tohiks annust tuletada hapnikutarbimise mõõtmisest.

Miks partii kuulub arutellu

Harrop ja Barron märkasid midagi, mis väärib teist lugemist. Metüleensinine ise tekitab spektroskoobis methemoglobiini kahe iseloomuliku riba vahele riba, „mis võib pealiskaudsel vaatlusel kergesti segadust põhjustada”. Värvaine võib jäljendada ainet, mida otsitakse.

Samal probleemil on ka keemiline vorm. Vähese koostisosana esineval sugulasfenotiasiinil on oma redokskäitumine, oma läbilaskvus ja oma toksilisus. Üks dokumenteeritud juhtum näitab probleemi konkreetselt: metüleensinise jodeerimise uuringus andsid proovid, mis sisaldasid ligikaudu 7 kuni 8 protsenti Azure B-d, peamiselt jodeeritud Azure B-d, nii et reaktsioonis domineeris lisand, mitte metüleensinine.

Igaüks, kes kasutab metüleensinist reagendina laboris, värvimistöökohal või akvaariumis, töötab määratlemata koostisainega, kui partiid ei ole iseloomustatud. Sugulasained, identiteet, elementlisandid, lahustijäägid ja kuumutusjääk on osa katsest, mitte seda ümbritsevast paberimajandusest. Blupreme hangib oma metüleensinise ravimitootjalt ja avaldab täieliku analüüsisertifikaadi, kontrollides kogu USP spetsifikatsiooni, mitte üksnes raskmetalle; analüüsisertifikaadi lugemise juhend ning selgitus selle kohta, mida USP-kvaliteediklassi tähistus kinnitab ja mida mitte käsitlevad dokumendi võrdlemist esitatud väitega.

Arv oli õige

1928. ja 1930. aasta katsed olid hoolikad ning nende keskne tähelepanek on püsinud: redutseeritav värvaine võib panna vaevu hingava raku tarbima hapnikku mitu korda kiiremini kui puhkeolekus, läbimata etappi, mille tsüaniid blokeerib.

Viga tekib hiljem, kui „hingamist” loetakse selle tänapäevases tähenduses. Gaasivahetuse mõõtmine ütleb, et elektronid jõudsid hapnikuni. See ei ütle, et mõnda neist kasutati ATP tootmiseks, ning mitokondriteta rakus on nende kahe väite vahe nii suur kui võimalik. Laiem ülevaade metüleensinise toimest rakkudes asetab sama eristuse avaramasse raamistikku ning ühendi ajalugu värvainest ravimiks selgitab, kuidas tekstiilivärvaine üldse nende katseteni jõudis.