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¿Quién desarrolló la tinción sanguínea púrpura? Azul de metileno, Malachowski, Romanowsky y Giemsa
La eosina es roja. El azul de metileno es azul. Mezcle ambos, aplique la mezcla a un frotis de sangre seco y partes del frotis vuelven a aparecer de color púrpura.
No todas las partes. En una buena preparación, los núcleos de los glóbulos blancos adquieren un rojo púrpura, y dentro de un parásito de la malaria la cromatina toma el mismo color, mientras que los glóbulos rojos circundantes permanecen rosados y el citoplasma permanece gris azulado. El púrpura es lo que permite que los tipos celulares se distingan entre sí.
Ninguna botella contiene púrpura. El color aparece solo cuando un producto de degradación específico del azul de metileno se encuentra con la eosina en el portaobjetos, y en las décadas de 1880 y 1890 nadie sabía que ese producto existía, ni mucho menos qué era. Las personas que perseguían ese color trabajaban con colorantes impuros, por separado, sin una forma fiable de saber qué había en una botella después de que hubiera permanecido dos meses en una estantería.
Por eso la pregunta del título tiene más de una respuesta defendible, y por eso la respuesta cambió en 2011.
Una lectura que cambió con la mezcla
La tinción no fue inventada. Se acumuló. Cada cambio en la mezcla aportó exactamente una nueva pieza de información visible, y la secuencia de esas piezas es la forma más clara de leer la historia.
| Año | Qué había en el recipiente | Qué se podía ver |
|---|---|---|
| 1865 | Ácido pícrico, el primer colorante sintético aplicado a la sangre, por Wilhelm Erb | Un patrón de encaje dentro de algunos glóbulos rojos. |
| 1876 | Azul de metileno, por Heinrich Caro y Adolf von Baeyer en BASF | Bacilos tuberculosos, en manos de Robert Koch. Células sanguíneas en un único tono azul. |
| 1880 | Azul de metileno más fucsina ácida, la tinción neutra de Ehrlich | Glóbulos rojos y gránulos de eosinófilos rojos, núcleos azul oscuro, citoplasma de linfocitos azul pálido y gránulos violeta oscuro que absorbían ambos colorantes. Por eso la célula se llama neutrófilo. El primer recuento diferencial de glóbulos blancos. |
| 1888 | Azul de metileno más eosina. Czesław Chęciński | El propio parásito: formas azules con aspecto de margarita (Plasmodium malariae) y formas en hoz de gametocitos (P. falciparum). No su núcleo. |
| 1890 | Más azul de metileno, menos alcohol, más hidróxido de potasio. Albert Plehn | Una gama de colores más amplia y profunda, incluyendo células rojas rosadas y gránulos de eosinófilos rosados. Seguían siendo solo rojo y azul. |
| 1890 | Eosina más azul de metileno alcalinizado con bórax. Ernst Malachowski | Cromatina rojo púrpura dentro del parásito, con el núcleo distinguido del citoplasma. Deliberado y, según su descripción, reproducible. |
| 1891 | Eosina más azul de metileno procedente de una botella mohosa de más de dos meses. Dmitri Romanowsky | El mismo púrpura, una sola vez, mediante un método que otros no pudieron repetir. |
| 1898 a 1902 | Colorante policromo extraído con cloroformo (Nocht); metanol (Jenner); redisolución alcohólica del precipitado (Leishman, Reuter, Wright); colorantes medidos con glicerol (Giemsa) | El púrpura bajo demanda, en un producto que se comportaba igual en el siguiente laboratorio. La versión de Jenner, sin colorante policromado, no produjo púrpura. |
| 1940 a 1943 | Lillie, Roe y Wilcox separaron los componentes y los probaron uno por uno | Azure B, no la mezcla, es la parte que produce el púrpura. |
El patrón de la última columna es el importante. Cada avance amplió la gama de colores, y cada ampliación hizo visible una estructura adicional. El púrpura no es una decoración de la técnica; es la diferencia entre ver que un parásito está presente y ver de qué está hecho. Cómo el propio colorante viajó desde una fábrica de tintes de BASF hasta la medicina es una historia más larga con sus propios documentos. La secuencia completa anterior, con la fuente detrás de cada entrada, se conserva como una cronología de colaboradores vinculada a fuentes.
Figura: las mismas seis mezclas dibujadas como lo que había en el recipiente y lo que salió de él. Los círculos contienen los colorantes; los bloques debajo contienen los colores que esos colorantes podían producir en un frotis de sangre. Nada antes de 1890 dibuja un bloque rojo púrpura, y nada después lo omite.
El hombre que utilizó bórax deliberadamente
Ernst Malachowski fue un médico de Breslau, actualmente Wrocław, que pasó su carrera en la práctica privada y en una pequeña clínica que dirigía con un colega, realizando trabajos de laboratorio en su propio tiempo. Nació en Strzelno el 12 de marzo de 1857, estudió medicina en la Universidad de Breslau y trabajó de 1882 a 1887 como asistente de medicina interna en el Hospital de Todos los Santos, entonces el segundo hospital más grande de Alemania.
Comenzó en 1888 con la doble tinción de Chęciński y Plehn. En una preparación realizada en 1889 vio que la cromatina del núcleo plasmodial se teñía de forma diferente al citoplasma y después descubrió que no podía reproducirlo. Intentó acidificar el azul de metileno, lo que empeoró las cosas. Intentó alcalinizarlo con bórax, lo que funcionó siempre. Demostró el método públicamente el 15 de junio de 1890 y publicó una descripción más completa en agosto de 1891, incluyendo la instrucción del bórax. Señaló que la tinción tardaba veinticuatro horas y que los resultados eran fácilmente reproducibles.
Veinticuatro horas es mucho tiempo en un laboratorio de diagnóstico, y su artículo no se detuvo en el color rojo púrpura del núcleo del parásito. Cualquiera que fuera la razón, nadie retomó la alcalinización deliberada del azul de metileno hasta que Nocht lo hizo de nuevo en 1898. Malachowski nunca volvió a escribir sobre tinción sanguínea.
La razón por la que se supo tan poco de él hasta hace poco es archivística, no misteriosa. Casi ningún rastro de su vida sobrevivió en la literatura médica, y lo que sobrevivió llegó por una sola vía. Su hija Marie dejó Alemania para Londres en 1939, sirvió en el Ejército británico y se estableció en Canadá, y su colección de documentos familiares terminó en el Leo Baeck Institute de Nueva York. Su hermano Leo murió en la Primera Guerra Mundial. Su hermana Eva fue deportada de Breslau al campo de tránsito de Izbica en abril de 1942 y nunca regresó. Su madre Hedwig se quitó la vida el 22 de abril de 1942 en lugar de esperar la misma deportación. Malachowski había muerto en 1934, antes de todo eso.
Una historia familiar que termina así es una historia familiar que deja de citarse. Los dos artículos que devolvieron a Malachowski al desarrollo de la tinción, ambos publicados en 2011, se recopilaron a partir de documentos de archivo de Poznań y Wrocław y de los documentos de Marie en Nueva York.
Una botella mohosa y un ruso afortunado
Dmitri Romanowsky estudió medicina en la Academia Médica Militar de San Petersburgo y trabajó con la malaria durante la mayor parte de su carrera. En 1890 publicó un método que era, sobre el papel, casi idéntico al de Chęciński: azul de metileno sin modificar y eosina, con un poco más de eosina.
En septiembre de 1891 publicó el método que hizo su nombre, y el detalle importante estaba oculto en las instrucciones. Sus mejores resultados procedían de die vorräthige Methylenlösung, una solución almacenada de azul de metileno que había permanecido durante más de dos meses con moho creciendo en ella. El moho y el tiempo de reposo habían desmetilado parcialmente el colorante. Romanowsky no lo sabía y no podía controlarlo, y otros investigadores que probaron su método no pudieron obtener el púrpura. Su tesis había sido presentada en San Petersburgo en junio de 1891, por lo que la versión estándar considera 1891 como el año del descubrimiento.
La demostración de Malachowski había sido en junio de 1890, más de un año antes, y su método funcionaba deliberadamente.
Por qué el epónimo fue para la persona equivocada
El caso de Malachowski fue reunido por Kristine Krafts, Ernst Hempelmann y Barbara Oleksyn, y se basa en cuatro elementos. La fecha de la demostración pública, junio de 1890 frente a septiembre de 1891. La palabra deliberado frente a la palabra fortuito. El hecho de que Malachowski publicara su método, con bórax incluido, mientras que el de Romanowsky dependía de una variable no controlada. Y la observación de que la descripción del núcleo plasmodial, junto con el púrpura que lo revelaba, desapareció efectivamente de la literatura durante siete años porque nadie podía reproducir la versión accidental.
Son directos sobre la conclusión. En el artículo biográfico llaman a la atribución "una farsa", y citan a Ralph Lillie, quien en 1978 escribió que "quizás deberíamos referirnos a esta familia de tinciones como tinciones de Malachowski".
La afirmación es discutida, como suelen serlo las reclamaciones de prioridad, y la forma del debate merece explicarse en lugar de resolverse. Un argumento sobre prioridad debe decir qué fue el descubrimiento. Si el descubrimiento es el color púrpura, Malachowski tiene la demostración documentada anterior. Si el descubrimiento es el método publicado, ambos hombres publicaron en 1891 y el epónimo fue para Romanowsky. Si el descubrimiento es la explicación, ninguno de los dos tiene una reclamación, porque ninguno sabía que la maduración era desmetilación y ninguno podía explicar por qué aparecía el color. Ese último punto es el que las narraciones populares omiten. El ingrediente activo era una impureza que nadie había identificado, y la primera persona que produjo el color deliberadamente lo hizo mediante una receta empírica reproducible, no mediante la comprensión de lo que hacía la receta.
Los dos artículos de 2011 son la exposición publicada más completa del caso de Malachowski, y ambos están disponibles gratuitamente en PubMed: la revisión extensa en PMID 21235291 y el artículo biográfico en PMID 21660627. El registro de PubMed de la revisión también enumera un comentario sobre ella, publicado en la misma revista más tarde ese año en 86(5):366, que recuerda que el argumento fue discutido en publicaciones desde el momento de su aparición.
Lo que la disputa no es es un desacuerdo sobre química. Todos los implicados coinciden sobre qué es el púrpura y qué componentes lo producen. El desacuerdo trata sobre quién llegó primero y sobre si un accidente que nadie pudo repetir cuenta como haber llegado al resultado.
Lo que aportaron los nombres posteriores
Si Malachowski produjo primero el púrpura, ¿por qué la tinción lleva los nombres de Romanowsky, Wright y Giemsa?
Porque una tinción que funciona una vez en manos de su inventor no es un reactivo. El trabajo posterior convirtió una mezcla inestable en algo que un técnico de otro país podía utilizar un martes.
Nocht llegó mediante razonamiento. Después de no obtener una respuesta fiable de un colorante neutro simple, concluyó que el púrpura debía proceder de algo del azul de metileno que no era azul de metileno, y fue a buscarlo. Unna ya había observado que las soluciones envejecidas de azul de metileno teñían de rojo los gránulos de mastocitos y propuso que una nueva sustancia se formaba mientras el colorante maduraba. Bernthsen había demostrado en 1885 que las condiciones alcalinas eliminan grupos metilo del azul de metileno, y que estos productos son lo que hoy llamamos azures. Nocht extrajo la fracción activa con cloroformo y solo pudo llamarla Rot aus Methylenblau, rojo del azul de metileno; Michaelis la denominó azure I en 1901. Jenner resolvió la logística. Redisolver el precipitado de azul de metileno y eosina en metanol absoluto produjo una única solución estable que fijaba el frotis mientras lo teñía y eliminó la fijación por calor. Leishman y Reuter combinaron colorante policromado con un disolvente alcohólico y obtuvieron estabilidad y el púrpura juntos. Wright sustituyó una incubación de doce horas a 65 °C y diez días de reposo por una hora con vapor circulante. Giemsa dejó de depender de una solución madurada al azar, utilizando cantidades medidas de colorantes conocidos con glicerol en el metanol para que el producto resistiera el calor tropical. Nunca publicó cómo fabricaba azure de metileno puro. Lo vendió al laboratorio del Dr. Grübler en Leipzig, que lo comercializó como azure I y afirmó que solo su versión era la auténtica tinción de Giemsa.
La identidad de ese azure todavía se discute. Algunos sostienen que era simplemente azul de metileno policromado, otros que era rico en azure B. La respuesta surgió de una guerra. Cuando los colorantes alemanes dejaron de estar disponibles, un equipo del Servicio de Salud Pública de Estados Unidos, Ralph Lillie junto con Maurice Roe y Aimee Wilcox, descubrió que la mejor tinción procedía de tres componentes separados: azul de metileno sin modificar, su producto de degradación desmetilado azure B y eosina. Azure B sustituyó al azure I no disponible, y esos tres componentes siguen siendo la base de la tinción utilizada para diagnosticar la malaria actualmente.
La química de cómo interactúan esos tres componentes en un portaobjetos es una cuestión separada y una página diferente. La función de los colorantes y la química de las tinciones tipo Romanowsky cubre qué hace cada uno, azure B y eosina, y por qué el par produce un color que ninguno produce por separado. Lo que cubre la página de microscopía y aplicaciones de laboratorio es el aspecto práctico: qué muestra una preparación determinada y cómo juzgar si un producto concreto es adecuado para el método que se pretende utilizar.
La parte de la historia que sigue vigente
Un detalle de esta historia no dejó de ser cierto en 1902. Durante aproximadamente cincuenta años, el componente más importante de la tinción estándar mundial para malaria fue una impureza sin nombre. Estaba allí por accidente, su cantidad variaba entre botellas, su identidad fue un secreto comercial durante parte de ese tiempo y su proporción fue discutida hasta la década de 1940. Las personas que utilizaban la tinción no eran descuidadas. No tenían forma de saber qué había en la