Wie Methylenblau in Zellen gelangt: Reduktion, Reoxidation, Aufnahme

Wer beobachtet, wie Endothelzellen in einer Kulturschale Methylenblau aufnehmen, gelangt leicht zu einer naheliegenden, aber falschen Deutung. Das Medium verliert seine blaue Farbe, in den Zellen entstehen blaue Granula, also muss der Farbstoff als blaues Molekül durch die Membran gelangt sein. Die Experimente zeigen etwas anderes. Die blaue Form passiert die Membran kaum. Was sie passiert, ist die farblose Form. Die im Zellinneren sichtbare blaue Form entsteht erst dort, nach dem Eintritt.

Diese Umkehrung ist entscheidend dafür, was eine Färbung aussagen kann und was nicht. Blaue Granula zeigen oxidierten Farbstoff an, der reoxidiert und in Organellen festgehalten wurde. Sie zeigen weder die Gesamtmenge des Farbstoffs in der Zelle noch den reduzierten Anteil an und messen auch keine biologische Wirkung. Warum das so ist, lässt sich anhand von drei Schritten nachvollziehen: Reduktion an der Oberfläche, Diffusion der reduzierten Form sowie Reoxidation und Festhalten im Zellinneren.

Die beiden Formen verhalten sich wie unterschiedliche Moleküle

Oxidiertes Methylenblau ist ein flaches, positiv geladenes Ringsystem. Es löst sich in Wasser, absorbiert Licht stark im Bereich von etwa 600 bis 700 Nanometern und erscheint blau. Entscheidend ist die Ladung. Ein geladenes, wasserliebendes Molekül passiert eine Lipidmembran nicht ohne Weiteres. Deshalb lautet die vorsichtige Formulierung in der Literatur relativ membranundurchlässig, nicht undurchlässig.

Reduziertes Methylenblau, auch Leukomethylenblau genannt, ist farblos, ungeladen und fettlöslich. Fällt die Ladung weg, stellt die Membran keine vergleichbare Barriere mehr dar. Das reduzierte Molekül diffundiert leicht hindurch. Sobald es sich in einem stärker oxidierenden Kompartiment befindet, kann es wieder Elektronen abgeben und in die blaue, geladene Form zurückkehren, die dort festgehalten wird. Die Redoxchemie des Farbstoffs ist somit zugleich sein Transportmechanismus. Ändert sich die Elektronenzahl, ändert sich auch die Membranpermeabilität.

Die Elektronen für den ersten Schritt stammen aus der Zelle selbst. Säugetierzellen betreiben Elektronentransport über die Plasmamembran und übertragen dabei Reduktionsäquivalente von intrazellulären Donoren nach außen auf Akzeptoren an der Oberfläche. Diese Aktivität über die Plasmamembran hinweg ist eine normale Zellfunktion, die bei den meisten Zelltypen vorkommt. Die Reduktase an der Endotheloberfläche, die Thiazinfarbstoffe umsetzt, verhält sich in einem aufschlussreichen Punkt wie andere solche Reduktasen: Sie arbeitet in Gegenwart von Cyanid und Azid bei Konzentrationen weiter, die die späteren Schritte unterbinden. Diese Trennung ist der entscheidende Punkt des gesamten Mechanismus.

Die Verteilung zwischen Phasen stand am Anfang und erklärte die Aufnahme beinahe

1929 stellte Marian Irwin am Rockefeller Institute eine einfachere Frage. Vielleicht beruht der Eintritt des Farbstoffs lediglich auf seiner Verteilung zwischen Wasser und den fetthaltigen Schichten der Zelle, und eine Chloroformschicht kann im Labor als Modell für diese Schichten dienen. Für ihre spektrophotometrischen Untersuchungen zum Eindringen von Farbstoffen schüttelte sie wässrige Farbstofflösungen mit Chloroform und verglich den Übergang in die organische Phase mit dem Eintritt in lebende Algenzellen.

Zwei Ergebnisse dieser Arbeit verdienen weiterhin Beachtung. Erstens enthielten handelsübliche Methylenblaulösungen Trimethylthionin, heute Azure B genannt. Diese Verunreinigung drang schneller ein als Methylenblau selbst, besonders bei alkalischem pH, bei dem die lipidlösliche Form der freien Base überwiegt. Ein Teil der vermeintlichen Methylenblauaufnahme war tatsächlich eine selektive Aufnahme von Azure B. Zweitens bestimmte der pH das Ergebnis, indem er den Ionisationszustand festlegte, und geschädigte Zellen ließen deutlich mehr Farbstoff hinein als intakte. Verteilungskoeffizienten und Ladungszustand bestimmten, was das künstliche System und die lebende Zelle jeweils aufnahmen. Die Ähnlichkeit zwischen beiden stützte die Vorstellung nichtwässriger Schichten in der Zellgrenze.

Das Modell nahm die Bedeutung von Lipiden und Ionisation vorweg. Es konnte jedoch nicht unterscheiden, ob ein Farbstoff unverändert zwischen den Phasen verteilt wird oder ob er an der Oberfläche chemisch umgewandelt wird, in dieser veränderten Form die Membran passiert und im Inneren zurückverwandelt wird. Für diese Unterscheidung war ein anderes Experiment nötig. Es folgte siebzig Jahre später am Lungenendothel.

Reduktion außen, Festhalten innen

Merker und Kollegen arbeiteten mit kultivierten Endothelzellen aus den Lungenarterien von Rindern und schlugen eine Abfolge aus drei Schritten vor: Der oxidierte Farbstoff wird an der Zelloberfläche zu seiner farblosen lipophilen Form reduziert, die reduzierte Form diffundiert hinein, und die intrazelluläre Reoxidation erzeugt erneut die membranundurchlässige oxidierte Form, die sich anreichert. In ihrer Studie zur Aufnahme von Thiazinfarbstoffen durch Endothelzellen prüften sie diese Abfolge anschließend, indem sie versuchten, sie an bestimmten Stellen zu unterbrechen.

Das erste Hilfsmittel war Ferricyanid, ein Elektronenakzeptor, der nicht in die Zelle gelangen kann. Wenn Oberflächenenzyme den blauen Farbstoff außerhalb der Zelle zu seiner farblosen Form reduzieren, kann Ferricyanid diese Elektronen wieder aufnehmen. Dadurch entsteht erneut blauer Farbstoff im Medium, noch bevor er die Membran passiert. Solange Ferricyanid im Überschuss vorhanden war (10 Mikromolar Farbstoff gegenüber 50 bis 500 Mikromolar Ferricyanid), kam die Farbstoffaufnahme nahezu zum Erliegen. Erst nachdem das Ferricyanid verbraucht war, setzte die Aufnahme mit ihrer normalen Geschwindigkeit wieder ein. Die Kinetik stützte dieselbe Erklärung auf einem zweiten Weg. Ferricyanid verschwand mit annähernd konstanter Geschwindigkeit. Das passte zu einem stetigen Reduktionsfluss an der Oberfläche, der einen wiederholt einsetzbaren Vermittler mit Elektronen versorgt. Der extrazelluläre Farbstoff dagegen verschwand exponentiell, während sein Vorrat abnahm. Ein konstanter Fluss bei gleichzeitig abnehmendem Farbstoffvorrat bedeutet, dass das Ferricyanidsignal eine fortlaufende Reduktion anzeigt, nicht das Verlassen der Lösung durch Farbstoffmoleküle.

Das zweite Hilfsmittel schloss den Membrandurchtritt vollständig aus. Die Gruppe koppelte Toluidinblau O, einen eng verwandten Thiazinfarbstoff, an eine große Polyacrylamidkette, die in beiden Oxidationszuständen zu groß für den Eintritt in die Zelle war. Die Zellen reduzierten den gebundenen Farbstoff dennoch. Die Reduktion erfordert somit keinen Zugang zum Zellinneren. Die dafür zuständige Maschinerie liegt an der Oberfläche frei oder ist elektrisch mit ihr gekoppelt.

Dann folgte die Trennung, auf die sich der Titel der Veröffentlichung bezieht. Cyanid und Azid unterdrückten bei 2 Millimolar die Farbstoffanreicherung stark. Unter dem Mikroskop verschwanden die dunkelblauen und violetten Einschlüsse, die normalerweise den Zellkern umgeben, nahezu vollständig. Dennoch verlangsamte keiner der beiden Hemmstoffe die extrazelluläre Reduktion: Der Ferricyanidzyklus lief unvermindert weiter, und das nicht membrangängige Polymer wurde weiterhin reduziert. Die Blockade lag in einem nachgelagerten Schritt. Cyanid und Azid unterbanden die intrazelluläre Reoxidation und Sequestrierung, nicht die Reduktion an der Oberfläche. Kontrollen der Zellviabilität stützten diese Deutung, denn die Zellen behielten bei diesen Behandlungen ihr zytosolisches Markerenzym Lactatdehydrogenase. Der Rückgang der Aufnahme ließ sich somit nicht einfach durch Vergiftung oder einen Membranbruch erklären.

Eine Einschränkung aus der Veröffentlichung gilt weiterhin. Die blauen Einschlüsse lagen um den Zellkern herum, aber nicht im Zellkern. Das war mit einer Oxidation innerhalb subzellulärer Organellen vereinbar, doch die Studie identifizierte diese Organellen nicht. Ähnliche Muster in anderen Zelltypen waren auf dürftiger Beweisgrundlage als lysosomal bezeichnet worden. Das Festhalten des Farbstoffs kann als belegt gelten, seine genaue Lokalisation als vorläufig. Wer verfolgen möchte, wohin die Elektronen als Nächstes gelangen, kann bei mitochondrialem Elektronentransport und Redoxprozessen sowie beim umfassenderen Überblick über Resorption und Verteilung nach Aufnahmeweg weiterlesen.

Färbung ist kein Maß für die Exposition

Eine dritte Studie zeigt, was geschieht, wenn dieser Aufnahmemechanismus mit einer biologischen Messgröße zusammenkommt. Scott und Kollegen stellten fest, dass Methyl-beta-Cyclodextrin, ein ringförmiges Zuckermolekül mit Torusform, Methylenblau direkt bindet. Die Assoziationskonstante des Einschlusskomplexes betrug etwa 310 pro Molar, gegenüber etwa 5846 pro Molar für die Dimerisierung des Farbstoffs. In L929-Fibroblasten blockierte diese Bindung sowohl die Zellfärbung als auch die Stimulation der Glucoseaufnahme: Eine Vorinkubation mit dem Cyclodextrin verhinderte die Blaufärbung, und eine spätere Zugabe beschleunigte die Entfärbung. Während das optisch messbare blaue Signal aus den Zellen verschwand, ging die Aktivierung des Glucosetransports in enger zeitlicher Parallelität zurück.

Die Autoren deuteten diese Korrelation als Hinweis darauf, dass eine direkte Wechselwirkung zwischen dem Farbstoff und einem Protein im Aktivierungsweg des Glucosetransporters wahrscheinlicher sei als ein lang anhaltender Mechanismus über oxidativen Stress. Diese Schlussfolgerung ist plausibel, hat aber Grenzen. Das Experiment identifiziert das Protein nicht, zeigt keine Bindung an den Transporter selbst, und die Korrelation zwischen Entfärbung und Wirkungsverlust kann nicht jeden redoxvermittelten Weg ausschließen.

Die bleibende Erkenntnis betrifft die Messung. Eine optische Färbung erfasst sichtbaren, oxidierten, zellassoziierten Farbstoff. Der farblose reduzierte Anteil bleibt vollständig unerfasst. Daher kann eine blasse Zelle weiterhin Farbstoffäquivalente enthalten, während eine intensiv gefärbte Zelle festgehaltenen oxidierten Farbstoff anzeigt und nicht die gesamte Gewebeexposition oder die Effektgröße. Dieselbe Einschränkung gilt auch auf größerer Ebene: Wer die Färbung verschiedener Zelltypen vergleicht oder einen dunklen Gewebeschnitt als Beleg für eine höhere Exposition wertet, wiederholt den ursprünglichen Fehler bei der Betrachtung der Kulturschale. Die Aufnahme ist ein Zyklus aus Reduktion, Diffusion und Reoxidation. Jede einzelne Momentaufnahme der blauen Form erfasst nur einen Teil davon. Daraus ergeben sich unmittelbar praktische Konsequenzen für Laborfärbung und Handhabung sowie für die Interpretation von Aussagen zu Dosis und Exposition.