Yr arbrofion a gysylltodd glas methylen â resbiradaeth gellog

Mae gwaed dynol wedi'i ddadffibrineiddio, wedi'i gynhesu i 37 °C am dair awr, yn defnyddio tua dau y cant o'r ocsigen sydd ynddo. Ychwanegwch ychydig o las methylen cyn y cyfnod deori, ac mae'r un gwaed yn defnyddio tua chwe deg pump y cant. Ni newidiodd dim am y celloedd. Dim ond yr hydoddiant a newidiodd.

Daw'r ffigur hwnnw o bapur yn 1928 gan George Harrop ac E. S. Guzman Barron yn Johns Hopkins, a dyma darddiad y datganiad a ailadroddir yn eang fod glas methylen yn gwella resbiradaeth gellog. Nid yw'r datganiad yn anwir, ond mae ei ystyr yn gulach nag y mae'n swnio.

Beth mae'r ffigur yn y tabl yn ei fesur mewn gwirionedd

Y mesur terfynol oedd cymeriant ocsigen, a bennwyd drwy ddadansoddi nwyon. Hidlodd Harrop a Barron waed newydd ei dynnu drwy wlân cotwm ar 10 °C i dynnu'r celloedd gwyn allan, dirlawnwyd y sampl ag ocsigen, ei rhannu, ychwanegu llifyn at un gyfran, a dadansoddi'r ddwy ar ôl deori. Anaml y byddai'r cyfrif lewcocytau yn fwy na rhyw fil fesul milimetr ciwbig. Adroddwyd y defnydd ocsigen fel y gyfran o gynnwys ocsigen cychwynnol y sampl a oedd wedi diflannu.

Mesurwyd carbon deuocsid hefyd, ac yno roedd y dull yn peri trafferth. Rhyddhaodd gwaed wedi'i ddadffibrineiddio hyd at ddau filimol o garbon deuocsid fesul 100 mL yn ystod yr awr gyntaf o ddeori am resymau nad oeddent yn gysylltiedig â'r adwaith dan astudiaeth, felly nid oedd modd defnyddio cyniferyddion resbiradol o waed cyflawn. Dim ond celloedd wedi'u golchi mewn hydoddiant Locke a roddodd ffigurau y gellid eu dehongli, ac roedd y rheini wedi'u clystyru rhwng 0.73 a 0.80 gyda'r llifyn a hebddo.

Nid manylyn dibwys yw hwnnw. Ystyr "resbiradaeth" yn y papurau hyn yw cyfnewid nwyon mewn llestr caeedig. Archwilir y bwlch rhwng defnydd ocsigen ac allbwn egni defnyddiol ar wahân yn yr hyn y mae defnydd ocsigen yn ei ddweud wrthych am ATP, a'r hyn nad yw'n ei ddweud.

Ychwanegodd y llifyn fwyaf lle'r oedd y celloedd yn resbiradu leiaf

Nid oes bron dim defnydd ocsigen mesuradwy mewn erythrocytau aeddfed mamaliaid. Mae defnydd ocsigen mewn erythrocytau adar sydd â chnewyllyn. Profodd Harrop a Barron y ddau, a'r cyferbyniad yw asgwrn cefn eu dadl.

Yn y samplau mamalaidd cynhyrchodd y llifyn gynnydd o ugain i hanner cant gwaith. Mewn gwaed gŵydd, yr oedd ei gelloedd eisoes yn resbiradu, ni wnaeth fwy na dyblu'r gyfradd erioed. Po uchaf oedd y resbiradaeth gychwynnol, lleiaf y gallai'r llifyn ei ychwanegu.

Mae'r un graddiant yn ymddangos o fewn un rhywogaeth. Defnyddiodd sampl dynol gan glaf â polycythemia vera, a oedd yn cynnwys celloedd anaeddfed, 11.3 y cant o'i ocsigen heb unrhyw lifyn yn bresennol, o'i gymharu â 2.8 y cant ar gyfer celloedd wedi'u golchi gan roddwr iach. Dim ond i 63.4 y cant y cododd y llifyn y defnydd, cyflymiad chwe gwaith lle cyflymodd celloedd normal bron i dri deg gwaith. Gwthiodd y llifyn gelloedd aeddfed tuag at ymddygiad celloedd anaeddfed, sef yr hyn y dywedodd yr awduron ei fod yn ei wneud.

Dylai cyanid fod wedi ei atal

Roedd yn hysbys bod cyanid yn atal ocsidiad cellog. Ychwanegodd Harrop a Barron ef beth bynnag, ochr yn ochr â'r llifyn.

Mae'r canlyniadau ar gyfer gwaed gwartheg yn gynrychioliadol. Gostyngodd y cynnwys ocsigen o 22.61 i 22.03 y cant yn ôl cyfaint dros dair awr heb unrhyw ychwanegiadau. Gyda glas methylen gostyngodd i 12.84. Gyda glas methylen a chyanid potasiwm ar grynodiad molar o un rhan mewn pum mil, gostyngodd i 12.74. Yn ei hanfod, ni effeithiwyd ar effaith y llifyn.

Ffigur: cofnod microresbiradaeth parhaus o erythrocytau dynol. Mae'r saeth yn nodi pryd yr ychwanegwyd glas methylen. Cyn hynny, mae'r llinell bron yn wastad; wedyn mae'n codi'n gyson. Atgynhyrchwyd o Harrop a Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Eu casgliad oedd bod y llifyn yn gweithredu fel cludydd ocsigen, "gan gyflenwi sylwedd sydd wedi diflannu o erythrocytau di-gnewyllyn mamaliaid aeddfed." Ddwy flynedd yn ddiweddarach, rhoddodd Michaelis a Salomon yn Sefydliad Rockefeller y ddadl yn ei ffurf barhaol. Naill ai roedd effaith y llifyn yn "briodwedd ddamweiniol y llifyn," neu roedd y llifyn yn "fodel ar gyfer rhyw sylwedd anhysbys yn yr organebau." Nid yw'r ddau bosibilrwydd hynny wedi'u datrys. Yr hyn sydd wedi newid yw bod modd disgrifio'r celloedd yn llawer mwy manwl erbyn hyn.

Gwnaeth echdynnyn o'r afu yr un peth

Dangosodd Michaelis a Salomon fod echdynion dŵr oer o organau yn cynhyrchu'r un ysgogiad. Afu llygod mawr oedd gryfaf, ac yna'r aren, y ddueg a'r gaill. Ychydig o effaith, neu ddim effaith o gwbl, a gafwyd gan yr ymennydd, cyhyrau a serwm gwaed.

Yna profwyd yr echdynnyn yn erbyn carbon monocsid. Ni newidiodd resbiradaeth a ysgogwyd naill ai gan yr echdynnyn neu'r llifyn mewn cymysgedd o 98 y cant carbon monocsid a 2 y cant ocsigen. Ataliodd yr un cymysgedd nwy resbiradaeth burum ac erythrocytau dofednod â chnewyllyn tua 60 i 80 y cant, yn unol â disgrifiad Warburg o ensym resbiradaeth sy'n sensitif i garbon monocsid. Felly nid ensym Warburg oedd y sylwedd meinwe anhysbys.

Diystyrwyd sawl sylwedd posibl ar hyd y ffordd. Cynhyrchodd glutathion rhydwythiedig a cystein ddim ond y defnydd ocsigen yr oedd ei angen ar gyfer eu hocsidiad eu hunain. Diystyrwyd coensym Harden a Young oherwydd mai cyhyrau sy'n cynnwys y mwyaf ohono, ond nhw a ddangosodd bron yr effaith leiaf. Daeth cytocrom Keilin, a enwyd ychydig flynyddoedd ynghynt, ar draws yr un gwrthddywediad. Galwasant eu hawgrym eu hunain, fod y sylwedd gweithredol yn dod o gnewyllyn y gell, yn awgrym yn unig.

Roedd amodau ynghlwm wrth yr effaith

Roedd rhaid i'r celloedd fod yn gyflawn. Diddymodd hemolysis drwy ddŵr distyll neu rewi dro ar ôl tro yr ymateb i'r llifyn ac i'r echdynnyn, a gostyngodd hemolysis rhannol yr ymateb yn gymesur.

Roedd angen siwgr hefyd. Cefnogodd glwcos, ffrwctos a swcros y resbiradaeth a ysgogwyd gan y llifyn; ni wnaeth manitol hynny. Heb unrhyw siwgr yn bresennol nid oedd resbiradaeth o gwbl, ac roedd yn ymddangos bod y llifyn yn niweidio'r celloedd yn y broses, felly ni wnaeth glwcos a ychwanegwyd awr neu ddwy yn ddiweddarach ei hadfer. Awgrymodd yr awduron fod y llifyn yn ocsidio cydran strwythurol yr oedd ei hangen ar y gell.

Cynyddodd goleuo effaith y llifyn yn sylweddol, er bod yr effaith yn amlwg yn y tywyllwch. Roedd llifynnau eraill y gellid eu rhydwytho yn ymddwyn yn wahanol: roedd glas tolwylen yn cyfateb i las methylen neu'n rhagori arno, tra na wnaeth diswlffonad indigo bron ddim. Ni ddaeth perthynas glir i'r amlwg rhwng potensial ocsidio-rhydwytho llifyn a maint ei effaith, a phriodolodd yr awduron hyn i athreiddedd pilenni a gwenwyndra.

Roedd yr effaith yn dilyn eplesiad, nid resbiradaeth

Symudodd astudiaeth Barron yn 1930 o ataliadau celloedd i dafelli meinwe o organau normal llygod mawr a thiwmorau wedi'u trawsblannu.

Mewn meinweoedd heb glycolysis aerobig, ni wnaeth glas methylen ddim neu ataliodd y defnydd ocsigen ychydig: yn yr aren tua 14 y cant, yn y pancreas tua 14 y cant, yn yr afu tua 5 y cant. Mewn meinweoedd sy'n eplesu ym mhresenoldeb ocsigen, cynyddodd y defnydd: yn y ddueg tua 8 y cant, yn yr ymennydd tua 13 y cant. Roedd y cynnydd mewn tiwmorau yn amrywio o tua 27 y cant mewn carsinoma bron dynol i fwy nag 80 y cant mewn sarcoma Rous mewn cyw iâr, yn fras yn gymesur â glycolysis aerobig pob meinwe.

Ffigur: mae pob pwynt yn un math o feinwe. Yr echelin lorweddol yw glycolysis aerobig; yr echelin fertigol yw'r newid yn y defnydd ocsigen ar ôl glas methylen. Data o Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Tabl 6, PMID 19869777.

Yna cynhyrchodd yr arbrawf cyanid y ddelwedd wrthdro. Pan ataliwyd resbiradaeth yn y meinweoedd hynny nad oeddent wedi ymateb o'r blaen drwy ddefnyddio cyanid, a phan ddaeth eplesiad i'r amlwg, cynyddodd y llifyn y defnydd ocsigen eto: yn yr aren tua 59 y cant, yn yr afu tua 19 y cant, yn y ddueg tua 286 y cant, yn y gaill tua 200 y cant.

Cynigiodd Barron y gallai'r llifyn fod yn brawf o allu eplesu cell neu feinwe, a gorffennodd â dyfaliad: gallai cenedlaethau o feithrin tiwmor mewn cyfrwng sy'n cynnwys llifyn un diwrnod beri i fetaboledd tiwmor fod yn barhaol debyg i fetaboledd meinwe normal. Cwestiwn ymchwil a ysgrifennwyd yn 1930 oedd hwnnw. Nid yw'n honiad am driniaeth.

Yr hyn na allai'r arbrofion fod wedi'i fesur

Yn 1928 a 1930, ystyr "resbiradaeth" oedd defnydd ocsigen. Adroddwyd am adenosin triffosffad am y tro cyntaf yn 1929, ac yn 1949 y daeth y dangosiad fod mitocondria wedi'u hynysu yn estereiddio ffosffad wrth drosglwyddo electronau. Ni allai unrhyw un o'r papurau cynnar ar las methylen fod wedi mesur cynhyrchu egni, ac ni honnodd yr un ohonynt eu bod wedi gwneud hynny.

Y celloedd yw'r ail broblem. Nid yw erythrocytau aeddfed mamaliaid yn cynnwys unrhyw fitocondria. Yn ystod y cam reticwlocyt maent yn clirio mitocondria a ribosomau drwy awtoffagi detholus, a dyna pam mae cell goch aeddfed yn gweithredu drwy glycolysis ac yn dibynnu ar ei llwybr ffosffad pentos yn bennaf am NADPH yn hytrach nag ATP. Yn arbrofion 1928 nid oedd cadwyn cludo electronau yn bresennol i'w hatgyweirio. Beth bynnag a oedd yn defnyddio'r ocsigen, roedd yn gwneud rhywbeth arall.

Mae'r hyn oedd y rhywbeth arall hwnnw bellach wedi'i ddisgrifio'n weddol dda. Mae glas methylen yn derbyn electronau o gyfwerthoedd rhydwytho cellog ac yn dod yn las lewcomethylen, sy'n cael ei ailocsidio gan ocsigen moleciwlaidd, gan gwblhau'r cylch. Mewn celloedd coch dynol, mae rhydwctas fflafin sy'n dibynnu ar NADPH a rhydwctasau deusylffid cysylltiedig yn cyflawni'r cam rhydwytho. Canfu astudiaeth yn 1976 a ddefnyddiodd glwcos wedi'i labelu fod y llifyn yn ysgogi'r siynt hecsos monoffosffad, fod yr effaith ar grynodiad isel yn dibynnu ar ocsihemoglobin, a bod crynodiad uwch, 0.1 mM, yn cynhyrchu hydrogen perocsid. Mae llifyn wedi'i rydwytho sy'n dod i gysylltiad ag ocsigen yn cynhyrchu perocsid, nid bondiau ffosffad.

Mewn mitocondria mae'r darlun yn fwy dadleuol nag y mae'r crynodebau poblogaidd yn cydnabod. Mae un trywydd gwaith yn dadlau bod y llifyn yn cymryd electronau o ardal cymhlygyn I ac yn eu trosglwyddo i gytocrom c. Canfu un arall na all adfer resbiradaeth mewn mitocondria ymennydd llygod ar ôl ataliad gan antimycin, a lleoli'r derbynnydd electronau yn safle rhwymo wbicwinol cymhlygyn III yn lle hynny. Canfu trydydd fod crynodiadau isel yn cynyddu defnydd ocsigen wrth orffwys heb newid resbiradaeth a ysgogwyd gan ADP. Y datganiad mwyaf uniongyrchol o'r pwynt yw nad yw defnydd ocsigen a ysgogir gan las methylen yn dibynnu ar ffosfforyleiddiad ocsidiol o gwbl: parhaodd pan ataliwyd y gadwyn resbiradol, ac mewn paratoadau heb un.

Mae mesuriadau uniongyrchol o'r bwlch rhwng y ddau fesur yn bodoli hefyd. Mewn mitocondria wedi'u hynysu o afu llygod mawr, gostyngodd crynodiadau cynyddol o lifyn gymarebau rheoli resbiradol ac achosi chwyddo, a ddisgrifiodd yr awduron fel datgyplu ffosfforyleiddiad ocsidiol. Mewn afu llygoden fawr wedi'i ddarlifo, cynyddodd glas methylen y defnydd ocsigen tra gostyngodd y gymhareb ATP i ADP.

Mae'r cofnod clinigol yn cyfleu'r un neges. Trinnir methemoglobinemia â thua un i ddau filigram o las methylen fesul cilogram yn fewnwythiennol, drwy lwybr rhydwytho sy'n dibynnu ar NADPH, ac mae dosau mwy yn achosi'r cyflwr sy'n cael ei drin. Mae'r un adolygiad yn nodi bod yr effaith fel gwrthwenwyn ar ei mwyaf mewn erythrocytau cyflawn ac yn lleihau pan fo hemolysis yn bresennol, sef canfyddiad hemolysis 1930 yn ailymddangos saith deg tair blynedd yn ddiweddarach mewn cyd-destun ysbyty. Nid yw cyfansoddyn y mae ei effeithiau defnyddiol a niweidiol ar ochrau cyferbyniol trothwy dos yn gyfansoddyn y dylid casglu ei ddos o fesuriad defnydd ocsigen.

Pam mae'r swp yn perthyn i'r drafodaeth

Sylwodd Harrop a Barron ar rywbeth sy'n werth ei ddarllen eilwaith. Mae glas methylen ei hun yn cynhyrchu band yn y sbectrosgop rhwng dau fand nodweddiadol methemoglobin, "a all yn hawdd beri dryswch wrth edrych yn fras." Gall y llifyn efelychu'r sylwedd y chwilir amdano.

Mae gan yr un broblem ffurf gemegol. Mae ffenothiasin cysylltiedig sy'n bresennol fel mân gydran yn meddu ar ei ymddygiad rhydocs ei hun, ei athreiddedd ei hun, a'i wenwyndra ei hun. Mae un achos wedi'i ddogfennu yn dangos yn benodol beth sydd yn y fantol: mewn astudiaeth o ïodineiddio glas methylen, cynhyrchodd samplau a oedd yn cynnwys tua 7 i 8 y cant Azure B Azure B wedi'i ïodineiddio yn bennaf, felly'r amhuredd yn hytrach na'r glas methylen a oedd yn dominyddu'r adwaith.

Mae unrhyw un sy'n defnyddio glas methylen fel adweithydd, mewn labordy, wrth fainc staenio, neu mewn acwariwm, yn gweithio gyda chynhwysyn amhenodol oni bai bod y swp wedi'i nodweddu. Mae sylweddau cysylltiedig, hunaniaeth, amhureddau elfennol, toddyddion gweddilliol, a gweddillion ar ôl tanio yn rhan o'r arbrawf yn hytrach na gwaith papur o'i amgylch. Mae Blupreme yn cael ei las methylen gan wneuthurwr fferyllol ac yn cyhoeddi tystysgrif ddadansoddi lawn, gan brofi'r fanyleb USP gyfan yn hytrach na metelau trwm yn unig; mae'r canllaw i ddarllen tystysgrif ddadansoddi a'r erthygl ar yr hyn y mae'r dynodiad gradd USP yn ei sefydlu, a'r hyn nad yw'n ei sefydlu yn egluro sut i wirio'r ddogfen yn erbyn yr honiad.

Roedd y ffigur yn gywir

Roedd arbrofion 1928 a 1930 yn ofalus, ac mae eu harsylwad canolog wedi dal ei dir: gall llifyn y gellir ei rydwytho beri i gell sydd prin yn resbiradu ddefnyddio ocsigen ar lawer gwaith ei chyfradd wrth orffwys, heb fynd drwy'r cam y mae cyanid yn ei atal.

Mae'r camgymeriad yn ymddangos yn ddiweddarach, pan ddarllenir "resbiradaeth" yn ei ystyr modern. Mae mesuriad cyfnewid nwyon yn dweud wrthych fod electronau wedi cyrraedd ocsigen. Nid yw'n dweud wrthych fod unrhyw un ohonynt wedi'i ddefnyddio i wneud ATP, ac mewn cell heb fitocondria mae'r bwlch rhwng y ddau ddatganiad hynny mor fawr ag y gall fod. Mae'r map ehangach o'r hyn y mae glas methylen yn ei wneud mewn celloedd yn gosod yr un gwahaniaeth mewn fframwaith ehangach, ac mae hanes y cyfansoddyn o lifyn i feddyginiaeth yn egluro sut y cyrhaeddodd lliwydd tecstilau'r arbrofion hyn yn y lle cyntaf.