Jak methylenová modř vstupuje do buněk: redukce, reoxidace a příjem

Když sledujete, jak endotelové buňky v kultivační misce přijímají methylenovou modř, nabízí se zjevné, ale nesprávné vysvětlení. Médium ztrácí modrou barvu a v buňkách se objevují modrá granula, takže barvivo muselo projít membránou jako modrá molekula. Experimenty však říkají něco jiného. Modrá forma prochází jen minimálně. Membránu překračuje bezbarvá forma a modré zbarvení, které vidíte uvnitř, vzniká až v buňce po jejím vstupu.

Toto obrácení běžné představy je důležité, protože určuje, co vám zbarvení může a nemůže říci. Modrá granula ukazují oxidované barvivo, které bylo reoxidováno a zachyceno v organelách. Neukazují celkové množství barviva v buňce, neukazují zásobu redukované formy a neměří biologický účinek. Abyste pochopili proč, sledujte tři kroky: redukci na povrchu, difuzi redukované formy a reoxidaci se zachycením uvnitř.

Obě formy se chovají jako různé molekuly

Oxidovaná methylenová modř je plochý, kladně nabitý kruhový systém. Rozpouští se ve vodě, silně absorbuje světlo přibližně v rozsahu 600 až 700 nanometrů a vypadá modře. Klíčový je právě náboj. Nabitá hydrofilní molekula neprochází lipidovou membránou snadno, proto literatura volí opatrnou formulaci, že membránou prochází poměrně obtížně, nikoli že jí neprochází vůbec.

Redukovaná methylenová modř, zvaná leukomethylenová modř, je bezbarvá, nenabitá a rozpustná v tucích. Odstraňte náboj a membrána přestane být překážkou. Redukovaná molekula snadno difunduje napříč membránou, a jakmile se ocitne v prostředí s vyšší oxidační schopností, může opět ztratit elektrony a vrátit se do modré, nabité a zachycené formy. Redoxní chemie barviva je tedy zároveň mechanismem jeho transportu. Změnou počtu elektronů se mění i prostupnost.

Elektrony pro první krok pocházejí ze samotné buňky. Savčí buňky přenášejí elektrony přes plazmatickou membránu a přesouvají redukční ekvivalenty od nitrobuněčných donorů směrem ven k akceptorům na povrchu. Tato aktivita napříč plazmatickou membránou je běžnou buněčnou funkcí, přítomnou u většiny typů buněk. Povrchová reduktáza endotelových buněk, která zpracovává thiazinová barviva, se v jednom výmluvném ohledu chová stejně jako jiné reduktázy: funguje i v přítomnosti kyanidu a azidu v dávkách, které zastavují pozdější kroky. Právě toto oddělení je klíčem k celému příběhu.

Rozdělování mezi fáze přišlo jako první a příjem téměř vysvětlilo

V roce 1929 položila Marian Irwin z Rockefellerova institutu jednodušší otázku. Možná je vstup barviva jen rozdělováním mezi vodu a tukové vrstvy buňky a při laboratorním pokusu může tyto tukové vrstvy zastoupit vrstva chloroformu. Ve svých spektrofotometrických studiích průniku protřepávala vodné roztoky barviv s chloroformem a porovnávala, co přechází do organické fáze, s tím, co vstupuje do živých buněk řas.

Dva poznatky z této práce si stále zaslouží pozornost. Za prvé, komerční roztoky methylenové modři obsahovaly trimethylthionin, dnes nazývaný Azure B, a tato nečistota pronikala rychleji než samotná methylenová modř, zejména při zásaditém pH, kdy převládá forma volné báze rozpustná v lipidech. Část zdánlivého vstupu methylenové modři byla ve skutečnosti selektivním vstupem Azure B. Za druhé, pH určovalo výsledek tím, že určovalo ionizační stav, a poškozené buňky přijímaly mnohem více barviva než neporušené. Rozdělovací koeficienty a nábojový stav určovaly, co absorbuje umělý systém a co živá buňka. Podobnost mezi nimi podporovala představu nevodných vrstev na buněčné hranici.

Model předvídavě zohledňoval lipidy a ionizaci, nedokázal však rozlišit barvivo, které se rozděluje mezi fáze beze změny, od barviva, které se na povrchu chemicky přemění, projde v jiné podobě a uvnitř se přemění zpět. K tomuto rozlišení byl zapotřebí jiný experiment, který přišel o sedmdesát let později v plicním endotelu.

Redukce vně, zachycení uvnitř

Merker a jeho kolegové pracovali s kultivovanými endotelovými buňkami plicní tepny skotu a navrhli tříkrokový sled: oxidované barvivo se na povrchu buňky redukuje na svou bezbarvou lipofilní formu, redukovaná forma difunduje dovnitř a nitrobuněčná reoxidace obnovuje oxidovanou formu, která membránou neprochází a hromadí se v buňce. Jejich studie příjmu thiazinových barviv endotelem tento sled následně ověřovala pokusy o jeho přerušení na konkrétních místech.

Prvním nástrojem byl ferrikyanid, akceptor elektronů, který nemůže vstoupit do buňky. Když povrchové enzymy redukují modré barvivo na jeho bezbarvou formu vně buňky, ferrikyanid může tyto elektrony odebrat zpět a obnovit modré barvivo v médiu ještě předtím, než vůbec překročí membránu. Dokud byl ferrikyanid přítomen v nadbytku (10 mikromolární barvivo oproti 50 až 500 mikromolárnímu ferrikyanidu), příjem barviva se téměř zastavil. Teprve po spotřebování ferrikyanidu se příjem obnovil obvyklou rychlostí. Kinetika ukázala totéž i jiným způsobem. Ferrikyanid ubýval přibližně konstantní rychlostí, což odpovídalo stálému toku povrchové redukce dodávajícímu elektrony opakovaně využívanému mediátoru, zatímco mimobuněčné barvivo ubývalo exponenciálně s tím, jak se jeho zásoba vyčerpávala. Konstantní tok spolu s ubývající zásobou znamená, že ferrikyanidový signál ukazuje průběžnou redukci, nikoli odchod molekul barviva z roztoku.

Druhý nástroj zcela odstranil krok průchodu membránou. Tým navázal toluidinovou modř O, blízce příbuzné thiazinové barvivo, na velký polyakrylamidový řetězec, který byl příliš velký na to, aby vstoupil do buňky v kterémkoli oxidačním stavu. Buňky přesto navázané barvivo redukovaly. Redukce tedy nevyžaduje přístup do nitra buňky. Příslušný mechanismus je přístupný na povrchu nebo je s ním elektricky propojen.

Poté přišlo oddělení procesů, které dalo studii její název. Kyanid a azid při koncentraci 2 milimolární výrazně potlačily hromadění barviva a pod mikroskopem téměř zmizely tmavě modré a fialové inkluze, které běžně obklopují jádro. Ani jeden inhibitor však nezpomalil mimobuněčnou redukci: cyklování ferrikyanidu pokračovalo v nezměněné míře a polymer, který membránou neprocházel, byl stále redukován. Blokáda tedy ležela v pozdější části procesu. Kyanid a azid zastavovaly nitrobuněčnou reoxidaci a zachycení, nikoli povrchovou redukci. Kontroly životaschopnosti tento výklad podpořily, protože buňky si během těchto zásahů zachovaly svůj cytosolický markerový enzym laktátdehydrogenázu. Pokles příjmu tedy nebyl jen důsledkem otravy buněk nebo porušení membrány.

Jedno upozornění z této práce platí dodnes. Modré inkluze se nacházely kolem jádra, nikoli v něm, což odpovídá oxidaci uvnitř subcelulárních organel, studie však neurčila, o které organely šlo. Podobné vzorce v jiných typech buněk byly na základě slabých důkazů označovány za lysozomální. Zachycení považujte za prokázané, jeho přesné místo za předběžné. Čtenáři, kteří sledují další cestu elektronů, mohou pokračovat tématem mitochondriálního transportu elektronů a redoxních procesů a širším pohledem na absorpci a distribuci podle cesty podání.

Zbarvení není expozice

Třetí studie ukazuje, co se stane, když se tento mechanismus příjmu setká s měřením biologické odezvy. Scott a jeho kolegové zjistili, že methyl-beta-cyklodextrin, cukerná molekula ve tvaru prstence, přímo váže methylenovou modř. Asociační konstanta inkluzního komplexu činí přibližně 310 na jednotku molární koncentrace, oproti přibližně 5846 na jednotku molární koncentrace pro dimerizaci barviva. Ve fibroblastech L929 tato vazba zablokovala jak zbarvení buněk, tak stimulaci příjmu glukózy: předinkubace s cyklodextrinem zabránila modrému zbarvení a jeho následné přidání urychlilo odbarvování. Jak optický signál modré barvy z buněk mizel, aktivovaný transport glukózy v těsné souvislosti s ním slábl.

Autoři tuto korelaci vyložili jako podporu přímé interakce mezi barvivem a proteinem v dráze aktivace glukózového transportéru spíše než mechanismu založeného na dlouhodobém oxidačním stresu. Tento závěr je rozumný, má však své hranice. Experiment neurčuje konkrétní protein, neprokazuje vazbu na samotný transportér a korelace mezi odbarvováním a ztrátou účinku nemůže vyloučit všechny dráhy zprostředkované redoxními procesy.

Trvalé poučení se týká měření. Optické zbarvení ukazuje viditelné, oxidované barvivo spojené s buňkou. Bezbarvou redukovanou zásobu zcela míjí, takže i slabě zbarvená buňka může obsahovat ekvivalenty barviva. Intenzivně zbarvená buňka zase ukazuje zachycené oxidované barvivo, nikoli celkovou expozici tkáně nebo velikost účinku. Stejné upozornění platí i ve větším měřítku: porovnávání zbarvení různých typů buněk nebo považování tmavého tkáňového řezu za důkaz vyšší expozice opakuje původní chybný výklad pozorování v misce. Příjem je cyklus redukce, difuze a reoxidace a jakýkoli jednotlivý snímek modré formy zachycuje jen jednu jeho část. Praktické důsledky pro laboratorní barvení a manipulaci i pro výklad tvrzení o dávce a expozici z toho přímo vyplývají.