Barvení methylenovou modří: mikroskopické metody a atlas skutečných snímků

Barvení methylenovou modří usnadňuje rozlišení jinak málo výrazných buněčných struktur při mikroskopii ve světlém poli. Může studentům pomoci najít jádro buňky z vnitřní strany tváře nebo prozkoumat obrysy a uspořádání mikroorganismů. Modrý objekt je však pouze pozorování. Určení organismu, jeho měření a rozhodnutí, zda ukazuje na onemocnění, jsou samostatné úlohy.

Úvodní obrázek znázorňuje princip kontrastu. Níže uvedený atlas obsahuje skutečné fotografie nezávisle zdokumentovaných vzorků s původními informacemi o jejich zdrojích.

Co methylenová modř odhaluje?

Methylenová modř je zásadité barvivo: její barevný iont nese kladný náboj. Jak vysvětluje OpenStax v kapitole o barvení preparátů, zásaditá barviva interagují se záporně nabitým buněčným materiálem a mohou zvýraznit buňky na světlejším pozadí. Ve vhodných preparátech methylenová modř zvýrazňuje oblasti bohaté na nukleové kyseliny a další struktury, které vážou barvivo.

Při jednoduchém barvení zajišťuje kontrast jediné barvivo. Různé organismy proto mohou vypadat modře, aniž by šlo o tentýž organismus. Užitečné otázky jsou zpočátku popisné: jsou objekty kulaté, nebo protáhlé, jednotlivé, nebo ve shlucích, rovnoměrně obarvené, nebo vnitřně rozlišené? Než budete barvu interpretovat jako výsledek klasifikace, seznamte se s rozdílem mezi jednoduchým barvením a Gramovým barvením.

Kontrast a rozlišení jsou odlišné vlastnosti. Kontrast pomáhá odlišit objekt od jeho okolí; rozlišení umožňuje rozlišit blízko ležící detaily. Tmavší obraz nezaručuje více rozlišených struktur. Ani každé tmavé zrníčko nelze označit za organelu.

Nativní preparáty, barvené vlhké preparáty a nátěry

Nebarvený neboli nativní vlhký preparát umožňuje pozorování bez přidaného barviva, i když vyjmutí z původního prostředí vzorek přesto mění. U barveného vlhkého preparátu se přidává činidlo, zatímco materiál zůstává v kapalině pod krycím sklíčkem. U fixovaného nátěru se materiál rozetře na podložní sklíčko a před dalším zpracováním se použije stanovená metoda fixace. Přehled přípravy preparátů od OpenStax rozlišuje vlhké preparáty od fixace a vysvětluje, proč fixované organismy již neumožňují pozorovat normální pohyb ani metabolismus.

Tyto preparáty odpovídají na různé otázky:

Pro srovnání ve výuce nejprve zdokumentujte nebarvený preparát a poté zkoumejte samostatný barvený preparát připravený podle výukového protokolu. Udržujte srovnatelné osvětlení a nastavení snímání. Pokud fotografujete dvě různé buňky, popište je jako příklady, nikoli jako záznam jedné buňky před barvením a po něm.

Mikroskopický atlas: tři skutečné barvené vzorky

Tento atlas představuje vlastní výběr a interpretaci tří mikrofotografií dostupných pod otevřenými licencemi. Autoři zdrojových snímků uvádějí vzorky a použitá barviva. Pravost jejich vzorků jsme nezávisle neověřovali. Snímky jsou reprodukovány bez ořezu jako bezeztrátové převody do formátu WebP, bez přidaných prvků či změn barev.

Snímek 1: lidské buňky z vnitřní strany tváře

Vzorek: lidské buňky z vnitřní strany tváře. Barvivo: methylenová modř. Zvětšení: 400×, podle údaje fotografa. Měřítko: není k dispozici; zdroj neuvádí kalibrovanou velikost pixelu. Fotografie od Fritzmann2002, 2017, ze souboru Lidské buňky z vnitřní strany tváře (barvení methylenovou modří), pod licencí CC BY-SA 4.0. Tato reprodukce zachovává stejnou licenci.

Začněte izolovanou buňkou: její tmavší jádro lze snáze odlišit od okolní modré cytoplazmy. Poté prozkoumejte překrývající se buňky pod ní. Překryv ztěžuje sledování hranice a může vytvořit místně tmavší oblast. Na tomto snímku si procvičujte sledování obrysů, nikoli počítání každé tmavé skvrny jako jádra. Průvodce pozorováním buněk z vnitřní strany tváře rozvíjí cvičení pro tento konkrétní vzorek.

Snímek 2: buňky cibule

Vzorek: buňky cibule podle označení zdroje. Barvivo: methylenová modř. Zvětšení: v původním názvu souboru je uvedeno „200x“; tento údaj není nezávisle ověřen. Měřítko: není k dispozici; kalibrace není uvedena. Fotografie od Alvy16, 2019, ze souboru Buňka cibule 200x, pod licencí CC BY 4.0.

Protáhlé oddíly tvoří uspořádanou vrstvu. Porovnejte jejich dlouhé společné hranice s nepravidelnými obrysy na snímku 1. Všimněte si také nápadného tmavého materiálu a nerovnoměrného jasu zorného pole. Fotografie neprokazuje identitu každé tmavé usazeniny. Ukazuje, proč užitečný záznam pozorování zahrnuje artefakty a nejistotu, namísto označování všeho, co se obarví.

Snímek 3: kvasinky označené zdrojem jako Candida spp.

Vzorek: Candida spp., podle fotografa. Barvivo: jednoduché pozitivní barvení methylenovou modří. Zvětšení: není k dispozici. Měřítko: není k dispozici; kalibrovaná velikost pixelu není uvedena. Fotografie od Marty, uživatelky Wikimedia Martunia.g, 2021, ze souboru Pozitivní barvení methylenovou modří 2, pod licencí CC BY 4.0.

Porovnejte husté modré shluky s méně zaplněnými okraji. Jednotlivé obrysy se snáze sledují tam, kde se objekty méně překrývají. Název Candida pochází ze zdrojového záznamu, nikoli z druhové identifikace provedené na této fotografii. Tento snímek neposkytuje ani výsledek stanovení životaschopnosti. Testy životaschopnosti a respirace kvasinek vyžadují vlastní podmínky, kontroly a interpretaci.

Jak správně číst měřítko

Tyto snímky umožňují vizuální srovnání, nikoli měření v mikrometrech nebo porovnávání absolutní velikosti buněk mezi snímky. Uvedené zvětšení nenahrazuje chybějící kalibraci kamery. Změna velikosti zobrazení snímku mění jeho zdánlivé zvětšení.

U vlastních snímků proveďte kalibraci měření pomocí známého standardu a příslušné optické sestavy. Průvodce mikrometrií od Nikon vysvětluje, jak objektový mikrometr převádí libovolné dílky obrazu nebo okulárové stupnice na fyzické délky. Zaznamenejte objektiv, konfiguraci kamery a kalibraci a z těchto údajů vytvořte měřítko. Neodvozujte je z průměrné velikosti buněk uvedené v učebnici.

Odpovídá obsah lahvičky dané metodě?

Lahvička s označením methylenová modř nepředstavuje úplnou laboratorní specifikaci. Zkontrolujte koncentraci a jednotky, rozpouštědlo, další složky, zamýšlené použití, dokumentaci šarže a pokyny. Bezpečnostní list činidla popisuje nebezpečí; pokyny k metodě stanovují, jak jej použít pro zamýšlený preparát.

Konkrétním příkladem je Löfflerův roztok methylenové modři od Merck. Výrobce jej označuje jako činidlo pro mikroskopii a popisuje jeho úlohu jako kontrastního barviva při barvení acidorezistentních mikroorganismů. Uvedená hořlavost také ukazuje, proč označení „modrá kapalina“ neposkytuje dostatek informací pro plánování manipulace nebo zahřívání. Tyto vlastnosti platí pro toto konkrétní složení, nikoli automaticky pro každý vodný roztok methylenové modři.

Podobně je agar s eosinem a methylenovou modří kultivační médium s definovaným složením. Nejde o barvení preparátu vytvořené přidáním samotné methylenové modři ke vzorku. Pro jiný cíl zobrazování porovnejte alternativy methylenové modři pro mikroskopii.

U mikroskopické sady pro začátečníky začněte její zdokumentovanou výukovou metodou, známými hotovými preparáty a předepsaným činidlem. Pokud lahvička ztratila etiketu nebo její složení nelze zjistit, nahraďte ji vhodným činidlem s dokumentací. Používejte ochranu očí a pokyny pro manipulaci dodané ke konkrétnímu přípravku. Lidský materiál a neznámé vzorky z prostředí vyžadují postupy výukové laboratoře pro manipulaci se vzorky a jejich likvidaci; barvení tyto postupy nenahrazuje.

Zapište pozorování před závěrem

„Modré oválné objekty ve shlucích“ je obhajitelný popis snímku. „Konkrétní infekce“ vyžaduje důkazy, které snímek neposkytl. V laboratorním deníku oddělujte původ vzorku, přípravu, barvicí reakci a metodu identifikace. Toto rozlišení činí jednoduchý výukový snímek užitečným a brání tomu, aby atraktivní mikrofotografie nesla tvrzení, které nemůže podpořit.